[发明专利]一种培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养液

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养液。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ES细胞)是通过分离内细胞团(Inner CellMass，ICM)细胞或早期胚胎的原始生殖细胞(Primordial Germ Cells，PGCs)，在体外合适的条件下抑制分化培养而得到的具有无限增殖能力，能进行自我更新(self-renewing)，具有分化为包括生殖系细胞在内的多种细胞的潜能的未分化细胞。ES细胞具有早期胚胎细胞的特征，在体外能进行传代、冷冻、复苏等操作仍保持正常二倍体核型。自从1981年英国剑桥大学的Evans和Kaufman、美国加州大学的Martin分别成功建立了小鼠的ES细胞系以来，胚胎干细胞的研究成为全世界范围内关注的焦点。1999年末，美国Science(《科学》杂志)公布的年度世界十大科学成果评选中，“干细胞研究的新发现”荣登榜首，而人类基因组计划工程却屈居第二。美国Time(《时代》周刊)将干细胞研究成果列为20世纪末世界十大科技成就之首。干细胞尤其是胚胎干细胞的研究成为21世纪生命科学领域中最具有发展和应用前景的一大热门话题，已成为继人类基因大规模测序完成后生命科学中最活跃的领域之一。

ES细胞在生命科学多个领域都有着广泛的用途，其中最令人兴奋的是医学应用潜能。ES细胞具有多向分化潜能，可在体外诱导分化为各种类型的干细胞或成熟细胞，在合适的条件下可能发育为完整器官，因此可能成为临床组织或器官移植材料的新来源，以取代病人体内损坏的细胞组织或器官，达到治疗组织缺损、遗传缺陷、器官障碍等难治疾病的目的。动物实验显示，ES细胞来源的血液细胞、神经细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌肉细胞等移植入体内可发挥相应功能，体外培养膀胱组织已经取得成功，表明ES细胞走入临床应用已经为期不远(Thomson，2000)。“治疗性克隆”是ES细胞在医学上应用的又一途径，具体程序是将病人体细胞(如皮肤细胞)的细胞核，移植到去核的卵母细胞内，然后使之融合，体外培养胚胎，发育到囊胚后取其内细胞团，建成ES细胞系，再诱导分化成供医疗使用的细胞或组织(Solter，1999)。

ES细胞研究提供了在细胞和分子水平上研究人及动物早期发育过程中相关问题的方法，可以帮助我们解决动物发育过程中的复杂问题，促进胚胎发育细节的基础研究，是研究脊椎动物早期胚胎发育的理想模型，有着广阔的应用前景。ES细胞技术结合基因打靶技术，用来研究动物体某些基因的功能。传统上，多用转基因或基因敲除动物模型作为基因功能分析方法，但周期较长。而利用ES细胞系可通过基因缺失和过度表达两种途径进行研究，缩短了周期。

利用ES细胞介导的转基因技术是目前认为最有效的转基因途径之一，可将所有的优良基因直接转入待改良的种群中，可形成有优良遗传品质的品系和高抗病力的品系。转移到鸡体内的基因有：牛生长激素基因、人类生长因子基因、鸡生长因子基因、潮霉素抗病毒基因、鸡抗马立克抗体基因、乙酰氯霉素转移酶基因等(Allioili，1994；Ebara，2000)。

ES细胞提供了对新药的药理、药效、毒理和药物代谢等研究的细胞水平研究手段，可大大减少药物检测所需动物的数量，降低成本。类胚体(EB)可用于某种新药或化学物质的毒性及效能的评估，这对药理学、化肥工业等领域的发展有重要意义。

关于鸡胚胎干细胞(CES细胞)的研究是目前国际上研究的热点之一。CES细胞的研究具有非常重要的意义。首先，鸡胚胎是研究脊椎动物早期发育的主要模型之一。其次，CES技术的一个主要应用就是通过对ES细胞的体外遗传操作，并筛选阳性细胞获得转基因鸡。通过ES途径用商品鸡生产药物蛋白。第三，生产有生物功能的治疗性药物。第四，进行转基因育种。在CES细胞细胞的研究的20年里，其ES细胞的建系很大程度上受小鼠全能或多能干细胞研究方法的影响，鸡的ES细胞系大都是通过分离培养未孵化的X期胚盘细胞或发育早期鸡胚PGCs所获得。

发明内容

本发明的目的是提供一种培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养液。

本发明提供的胚胎干细胞培养液，是将80％(体积比)大鼠肝细胞条件培养基和20％(体积比)ES细胞基础培养液混合得到的；

所述大鼠肝细胞条件培养基是培养BRL细胞得到的培养液；

所述ES细胞基础培养液为高糖DMEM，含有如下溶质：3.5-4.5g/L葡萄糖、10-15％胎牛血清(体积比)、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、0.1-0.15mMβ-巯基乙醇、1-1.5mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3％鸡血清(体积比)、抗菌素。