[发明专利]一种筛选解除葡萄糖代谢阻遏的丁醇产生菌突变株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选解除葡萄糖代谢阻遏的丁醇产生菌突变株的方法。

背景技术

世界范围内石油等化石燃料供应的短缺，天然气和其他原料价格的上扬，以及 对温室气体减排的要求，迫使人们转向制备可再生能源，关注生物燃料的发展前景。 丁醇就是备受关注的生物燃料之一。丁醇是一种重要的化工原料，主要用于制造增 塑剂、溶剂、萃取剂等，全球年需求量超过140万吨。丁醇又是一种极具潜力的新 型生物燃料，其热值、辛烷值与汽油相当；含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相 近；不会腐蚀管道，便于管道输送；蒸汽压低、安全性高，且能与汽油以任意比混 合。

丁醇可由化学合成法和发酵法生产。化学合成法的主要路线包括两条，一是以 丙烯为原料，经羰基合成法生成正、异丁醛，加氢后分馏得到正丁醇；二是以乙醛 为原料，经醇醛缩合成丁醇醛，脱水生成丁烯醛，再经加氢后得到正丁醇。发酵法 则是以粮食为原料，经发酵获得丙酮、丁醇和乙醇(三者质量比3∶6∶1)，再经精 馏后分别制得丙酮、丁醇和乙醇。发酵法生产丙酮丁醇是仅次于乙醇发酵的全球第 二大发酵工业。随着石油价格的不断上涨，丙酮丁醇发酵重新获得人们的重视。

发酵法生产丁醇过程中所使用的菌种是成功生产丁醇的关键因素。研究表明， 当培养基中有葡萄糖存在时，丙酮丁醇梭菌将首先利用葡萄糖，当葡萄糖利用完毕 后，再开始利用其他糖类如淀粉、乳糖和蔗糖等。正是这种“葡萄糖抑制效应”的 存在，使丙酮丁醇梭菌中的淀粉酶受到抑制，当培养基中的葡萄糖消耗完以后，菌 株才能利用淀粉酶来分解淀粉。

目前，主要是以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)为出发菌株，以淀粉 为原料，利用发酵法生产丁醇。现已有多篇针对发酵工艺进行改进的专利，如果能 对丁醇产生菌自身进行改造，解除葡萄糖抑制效应，使丁醇产生菌能更加有效地利 用葡萄糖使之转化为丁醇，则能够进一步提高丁醇的产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选丁醇产生菌突变株的方法。

本发明所提供的筛选丁醇产生菌突变株的方法，包括以下步骤：

1)将丁醇产生菌进行化学诱变，得到突变株；

2)将上述步骤1)获得的突变株培养于含有葡萄糖结构类似物和可溶性淀粉的 固体梭菌培养基中，挑取降解淀粉的单菌落转接入葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌 培养基中培养，得到丁醇产生菌突变株。

上述方法还包括将所述丁醇产生菌突变株进行淀粉降解能力的筛选得到突变 株，将突变株转接入葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基中培养的步骤。

可将上述筛选得到的丁醇产生菌突变株再进行化学诱变，将经过诱变的丁醇产 生菌突变株培养于含有葡萄糖结构类似物和可溶性淀粉的固体梭菌培养基中，挑取 降解淀粉的单菌落转接入葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基中培养，得到丁醇 产生菌突变株的步骤。

上述过程至少重复一次。

当然，上述丁醇产生菌突变株的筛选方法也可以只包括步骤1)和2)的过程。

上述方法中，所述葡萄糖结构类似物具体可为2-脱氧葡萄糖。

上述方法中，所述含有葡萄糖结构类似物和可溶性淀粉的固体梭菌培养基的组 成为：2-脱氧葡萄糖2g/L、可溶性淀粉5g/L、硫酸镁0.02g/L、硫酸锰0.01g/L、硫 酸铁0.01g/L、氯化钠0.01g/L、乙酸铵2.2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、 生物素2μg/L、维生素B₁ 1mg/L、对氨基苯甲酸1mg/L、琼脂2g/L，其余为水；

所述葡萄糖终浓度为20-70g/L的梭菌培养基的组成：葡萄糖20-70g/L、硫酸镁 0.02g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、氯化钠0.01g/L、乙酸铵2.2g/L、磷酸二 氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、生物素2μg/L、维生素B₁ 1mg/L、对氨基苯甲酸 1mg/L，其余为水。

所述化学诱变所使用的诱变剂为硫酸二乙酯，所述硫酸二乙酯的终浓度为 0.2-1％，具体可为1％，所述诱变时间为10-40min，具体可为15min。