[发明专利]将蛋白定位于细胞膜和/或细胞壁的多肽及其应用有效
申请号: | 200810241003.9 | 申请日: | 2008-12-24 |
公开(公告)号: | CN101759782A | 公开(公告)日: | 2010-06-30 |
发明(设计)人: | 金城;欧阳浩淼;陈晓敏 | 申请(专利权)人: | 中国科学院微生物研究所 |
主分类号: | C07K14/38 | 分类号: | C07K14/38;C12N15/31;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/11 |
代理公司: | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人: | 关畅;任凤华 |
地址: | 100080 北*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 蛋白 位于 细胞膜 细胞壁 多肽 及其 应用 | ||
技术领域
本发明涉及将蛋白定位于细胞膜和/或细胞壁的多肽及其应用。
背景技术
真核细胞内蛋白质的GPI(glycosylphosphatidylinositol)修饰是一种保守的翻 译后糖基化修饰,可将蛋白质定位于细胞膜上,同时也是蛋白质转运的一种途径。GPI 修饰的蛋白质通常带有一段疏水的N-端信号肽和一段C-端疏水信号肽;其中N-端信号 肽是蛋白质外泌所必需的,而C-端信号肽则GPI修饰的信号,含有一个位于C-端17-25 位的ω-氨基酸。在内质网中由转氨酶复合体催化将GPI共价连接到ω-位点。高等真核 生物的GPI蛋白最终定位于细胞膜上,而在真菌中许多GPI蛋白还被定位于细胞壁上, 细胞膜和细胞壁定位的蛋白质有着不同的功能。
目前已对酵母GPI蛋白的细胞定位信号有一定了解,对模式生物啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的研究表明,定位于细胞膜的某些GPI蛋白可在GPI的 糖链部分发生断裂,然后通过残留的在蛋白上的糖残基使蛋白与细胞壁上的β-1,6-葡 聚糖连接,从而将蛋白定位到细胞壁上。研究发现,酵母GPI信号肽中ω-位点上游的4 个氨基酸残基中如果有2个碱性氨基酸,则蛋白质将被定位于细胞膜;如果没有碱性氨 基酸或碱性氨基酸被疏水氨基酸代替,蛋白质就会被定位到细胞壁上;如果GPI蛋白的 C-端富含丝氨酸和苏氨酸(高于30%)也会使蛋白定位于细胞壁,说明GPI蛋白的定位 信号可能不止一种。另外,一些GPI蛋白往往在细胞膜和细胞壁上均有分布,对这些蛋 白的定位目前还有争议。尽管对酵母GPI蛋白的定位信号还需进行深入的研究,但GPI 信号肽的细胞定位功能已被成功应用于外源蛋白在酵母细胞表面的定位表达。
与酵母GPI蛋白相比,对丝状真菌的GPI蛋白的了解还非常有限。烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)是一种广泛存在于自然界中的丝状真菌,其细胞壁合成与 GPI蛋白密切相关。有证据表明丝状真菌的GPI蛋白也与酵母一样参与蛋白质的转运 和定位,但又与酵母有显著的不同。
发明内容
本发明的目的是提供一种将蛋白定位于细胞膜和/或细胞壁的多肽及其应用。
本发明所提供的将蛋白定位于细胞膜和/或细胞壁的多肽,其氨基酸序列为序列表 中的序列1,所述多肽命名为AfGel1。
编码所述多肽的DNA分子也属于本发明的保护范围。
编码所述多肽的DNA分子具体可为如下的1)或2)或3):
1)其核苷酸序列是序列表中的序列2;
2)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述多 肽的DNA分子;
3)与1)的DNA分子具有90%以上的同源性,且编码权利要求1所述多肽的DNA分子。
所述步骤3)中的基因,与1)的基因最好有95%以上的同源性。
上述严格条件可为在6×SSC,0.5%SDS的溶液中,在68℃下杂交,然后用2× SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
含有所述DNA分子的重组表达载体或重组菌、扩增所述DNA分子全长或其任意片 段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明的多肽与GFP蛋白融合的,成功的将GFP蛋白定位于细胞膜和/或细胞壁上。 本发明的多肽不仅为外源蛋白提供了定向表达的方法,而且为在细胞表面定位表达蛋 白用于生物转化提供工具。本发明的将蛋白定位于细胞膜的多肽为研究烟曲霉基因蛋 白功能提供了一个很好的平台,同时对于了解烟曲霉蛋白转运提供了一个良好的介质。
附图说明
图1为菌株鉴定结果。
图2为烟曲霉中GFP蛋白的表达。
图3为荧光显微镜观察GFP蛋白的定位。
具体实施方式
一、构建pchiGFP表达载体
提取烟曲霉YJ407 CGMCC 0386(ZL99105415.6)的基因组DNA。基因组DNA的 提取方法参照《分子克隆实验指南》。
设计引物ChiG-N和ChiG-C,ChiG-N和chiG-C的核苷酸序列如下:
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