[发明专利]一种微囊藻毒素-LR单抗免疫亲和柱的制备和使用方法

说明书

技术领域

一种微囊藻毒素-LR单抗免疫亲和柱的制备和使用方法，属于免疫亲和层析及微囊藻毒素检测技术领域。

背景技术

蓝藻是地球上的最古老生物之一，水体的富营养化有利于蓝藻的繁殖和生长。水体中的蓝藻短时间内大量繁殖并聚集的生态异常现象称为水华(也称湖靛)。最近的调查表明，亚太地区54％的湖泊富营养化，欧洲、非洲、北美洲和南美洲的比例分别是53％，28％，48％和41％，我国则是60％。近年来我国几大淡水湖泊都有蓝藻水华的大量爆发。蓝藻水华出现时，水面被厚厚的蓝绿色湖靛所覆盖，甚至在岸边大量堆积。在藻体大量死亡分解的过程中，不但散发恶臭，破坏景观；同时大量消耗水中溶解氧，使鱼类窒息死亡；尤其是蓝藻能释放生物毒素——微囊藻毒素(MC)，这些类次级代谢产物严重危害人类和其他生物的安全。其中微囊藻毒素-LR(MC-LR)

蓝藻水华产生的MC毒性极强，1996年巴西发生透析液受MC污染的事故，造成50多人死亡。MC还是潜在的致癌因子和肿瘤促进因子。MC引起野生动物和家畜中毒甚至死亡的事件在世界各地都有报道。目前对蓝藻水华的发生及MC的危害尚没有有效的控制方法，建立有效的检测方法和制定水体、饮用水和一些食品的MC限制标准实为可行的预防措施。考虑到饮水安全，WHO和我国GB 5749-2006生活饮用水卫生标准规定饮用水中MC-LR的限量值为1μg/L。

免疫亲和柱(IAC)是利用免疫亲和层析原理制作的分离分析预装柱。由于抗体与抗原作用具有高度专一性，因此通过IAC净化能够去除绝大部分杂质。IAC技术已日渐成熟，在与藻毒素类似的真菌毒素的检测中已广泛应用，其中黄曲霉毒素的免疫亲和层析已被列入国标中(GB18980-2003和GB18979-2003)。

由于蓝藻样品成份复杂，其中的MC含量低(质量百分比在万分之一左右)，如果在前处理过程中杂质残留多，在后续定量分析中，能严重影响结果的准确性。我们通过蓝藻样品的溶剂提取、固相萃取(SPE)柱富集、IAC净化，然后进液质联用仪进行定量测定，能得到准确的结果。此文建立的方法能应用于水样、其它藻类及类似的生物样品中MC的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种MC-LR单抗IAC的制备和使用方法，所研制的IAC是将MC-LR单抗固定于柱中，通过蓝藻样品的溶剂提取、固相萃取(SPE)柱富集、IAC净化，然后进液质联用仪进行定量测定，能得到准确的结果。本发明建立的方法能应用于水样、其它藻类及类似的生物样品中MC的检测。

本发明的技术方案：一种MC-LR单抗IAC的制备方法：

(1)用水溶性碳二亚胺法制备MC-LR与牛血清白蛋白BSA偶联物，以下简称MC-LR-BSA，用MC-LR-BSA作为免疫原；用混合酸酐法制备MC-LR与载体蛋白OVA的偶联物，以下简称MC-LR-OVA，用MC-LR-OVA作为检测抗原；通过免疫方法获得MC-LR单抗；

(2)琼脂糖凝胶Sepharose 4B的活化：用溴化氰法活化Sepharose 4B，活化过程如下：

(a)取10mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分两次洗涤后抽干，加少量的0.1mol/L pH 8.3的NaHCO₃洗涤，立即转入100mL烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；

(b)在通风橱内称取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批加入Sepharose4B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/LNaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反应完全，pH保持不变，停止搅拌；

(c)将活化的Sepharose 4B加入小冰块，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/L pH 8.3的NaHCO₃抽洗；

(3)MC-LR单抗IAC的制备：

MC-LR单抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B偶联得到亲和吸附剂，填入柱中制得MC-LR单抗免疫亲和柱，操作步骤如下：

(d)偶联