[发明专利]摩尔根氏变形杆菌的(D)-专一性羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成

说明书

技术领域

摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)CMCC(B)49208的(D)-羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成，该(D)-专一性羰基还原酶基因用于生物法拆分外消旋化合物，属于生物工程技术领域。

背景技术

光学纯d-伪麻黄碱，在医药上是多功能多用途的药物。在临床上主要用于支气管哮喘，过敏型反应，低血压及鼻粘膜充血肿胀引起的鼻塞等治疗。由于麻黄碱分子中含有复合官能团，因此还常被用于有机合成，研制新型药物。因此，开展麻黄碱拆分方法的研究极有意义。

利用生物法转化制备光学纯的手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行的反应等优点。合成光学活性物质转化反应大致可分为两类：一类是把外消旋体拆分为两个具有光学活性的对映体；另一类是从外消旋或手性的前体出发，通过催化反应得到不对称的光学活性产物。

90年代起国际上对微生物及酶拆分手性化合物进行大量的研究。酶由氨基酸构成，其活性中心构成了一个不对称环境，有利于对消旋体的识别，是一种高度手性的催化剂。其催化效率高，有较强的专一性。酶促拆分消旋体是比较理想的选择。利用完整细胞对外消旋化合物进行转，可以获得光学纯对映体，在非水相及有机—水双相反应体系中，也可酶促转化制备光学纯化合物。

目前，部分立体选择性氧化还原酶基因已通过基因工程手段获得，而对于来源于Morganella morganii CMCC(B)49208的立体选择性氧化还原酶基因，国内外研究很少，其基因组序列等信息几乎为空白。

发明内容

本发明的目的是提供Morganella morganii CMCC(B)49208的(D)-羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成，以便利用该基因的重组菌株进行外消旋手性拆分，并为进一步研究用于手性拆分的微生物立体选择性氧化还原酶的多样性，转化途径及反应机理创造条件。

本发明的技术方案：摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1。该摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2。

通过对立体选择性氧化还原酶酶学性质进行研究，认为来源于Morganellamorganii CMCC 490868的(D)-羰基还原酶将底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)转化为d-伪麻黄碱的反应机理为：在NAD⁺的存在下，添加葡萄糖，葡萄糖脱氢酶，使NAD⁺还原为NADH，然后在NADH的存在下，将底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)不对称还原为d-伪麻黄碱。

该酶催化氧化还原反应的最合适的初始pH为7.5，最合适的转化温度为30℃。底物MAK浓度、葡萄糖的添加量和葡萄糖脱氢酶的浓度分别为150mg/L、100μmol/L、15U/mL。

本发明所采用的微生物为摩尔根氏变形杆菌(Morganella morganii)，保藏于中国医学细菌保藏管理中心，保藏号CMCC(B)NO.49208。

本发明的有益效果：本发明用转化效果较好的菌株Morganella morganiiCMCC(B)49208，分离获得(D)-羰基还原酶进行不对称转化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)得到单一产物d-伪麻黄碱。

经转化液组成和转化条件优化后，所用酶蛋白不对称转化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)，产物的产量有较大的提高，确定了优化的转化液组成和转化条件。

获得Morganella morganii CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶的基因，并利用表达该基因的重组大肠杆菌进行外消旋手性拆分，为进一步研究用于手性拆分的微生物立体选择性还原酶的多样性、转化途径及反应机理创造条件。

附图说明

图1CMCC(B)49208的(D)-羰基还原酶的肽指纹图谱。

具体实施方式

Morganella morganii CMCC(B)49208的(D)-专一性羰基还原酶基因的PCR产物经试剂盒纯化后，利用BigDye测序试剂盒和应用生物系统自动DNA测序仪进行核苷酸序列的测序，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，该还原酶氨基酸组成为SEQ ID NO：2。