[发明专利]一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法

权利要求书

1.一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法，是将野生型淀粉液化芽孢杆菌ES-2的fengycin合成酶基因的启动子Ppps置换为启动子P59的方法，其特征在于，

1)启动子P₅₉序列的克隆

设计启动子P₅₉的引物：

上游引物：5’-ctttattgttttgccatt-3’

下游引物：5’-ggataagaaagtgaaataacaaactgtcaaataaagta-3’

采用上述引物并以质粒pHB201做为模板，扩增获得一个长377bp的P₅₉启动子序列；

2)fengycin合成酶基因同源片段及新霉素抗性基因的克隆

设计淀粉液化芽孢杆菌fengycin合成酶基因5’端的DNA片段引物序列，

上游引物：5’-tactttatttgaagtttgttatttcactttcttatcc-3’

下游引物：5’-ccaaacttcttgtctg-3’

以淀粉液化芽孢杆菌ES-2基因组DNA为模板，扩增获得一个长450bp的fengycin合成酶基因同源片段SEQ ID NO.1，即淀粉液化芽孢杆菌fengycin合成酶基因5’端部分片段；

设计新霉素抗性基因的引物，

上游引物：5’-ccggaattcgcgaccttccactcaccggtt-3’

下游引物：5’-ccggaattccggggcaatgaaattagactat-3’

从质粒pMK3扩增得到新霉素抗性基因片段1153bp；

3)同源整合载体的构建

将PCR产物分别纯化后，通过SOE PCR的方法将启动子P₅₉DNA片段和fengycin合成酶基因同源片段连接到一起，ddH₂O重溶，与pMD19-T载体连接，得到质粒载体pMD19-T1，然后在质粒载体pMD19-T1的EcoRI位点加上新霉素抗性基因，得到质粒载体pMD19-T2，将pMD19-T2转化大肠杆菌TOP10F’，获得同源整合载体转化的大肠杆菌TOP10F’；

4)同源整合载体转化淀粉液化芽孢杆菌野生菌株ES-2

将同源整合载体转化的大肠杆菌TOP10F’，提取同源整合载体质粒，转化感受态淀粉液化芽孢杆菌野生菌株ES-2，获得同源整合载体转化的淀粉液化芽孢杆菌ES-2菌株，即启动子P59置换的菌株。

2.权利要求1所述方法得到的置换菌株。

3.权利要求2所述置换菌株的鉴定方法，其特征在于：

设计引物：

上游引物：5’-ctttattgttttgccatt-3； 

下游引物：5’-ccaaacttcttcgtctg-3，

以启动子P₅₉置换的菌株基因组DNA为模板，在100μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM，淀粉液化芽孢杆菌基因组DNA10ng，4U pfu DNA聚合酶；扩增程序为94℃2min；30个循环：94℃50s，53℃50s，72℃90s；72℃10min；

如果扩增得到大小826bp的DNA片段，即是启动子P59片段和淀粉液化芽孢杆菌ES-2fengycin合成酶基因5’端部分DNA片段连接到一起，并整合到野生淀粉液化芽孢杆菌ES-2的基因组DNA中的DNA片段，即为启动子P₅₉置换的菌株。