[发明专利]一种抵御冷冻胁迫乳杆菌基因工程菌的构建方法

说明书

技术领域

一种抵御冷冻胁迫乳杆菌基因工程菌的构建方法，本发明利用高效率乳杆菌电转化感受态的制备，大肠杆菌谷胱甘肽基因的导入，NICE表达系统的构建，以及谷胱甘肽基因的诱导表达，进行该基因工程菌的构建。属于生物工程技术领域。

背景技术

乳杆菌是一类使用广泛的益生菌，在食品发酵行业被广泛应用。由于乳杆菌的最适生长温度一般在30℃-37℃，而在实际生产中，起酵物的冷冻保藏、低温培育和发酵产品的冷藏过程都将使乳杆菌要经历远低于最适生长温度的冷冻条件，从而影响其生命力。

研究发现，乳杆菌胞内谷胱甘肽含量的增加能显著提高其对于冷冻胁迫的耐受能力，但部分乳杆菌本身不具备合成谷胱甘肽的能力，或合成谷胱甘肽的能力较弱。将谷胱甘肽合成基因导入乳杆菌，使其在少量食品级诱导物nisin的诱导下，自身合成谷胱甘肽，提高乳杆菌对于冷冻条件的适应能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种抵御冷冻胁迫乳杆菌基因工程菌的构建方法，提高乳杆菌对于冷冻条件的适应能力。

本发明的技术方案的详细描述：一种抵御冷冻胁迫乳杆菌基因工程菌的构建方法，通过高效率乳杆菌电转化感受态的制备，导入谷胱甘肽基因的质粒pNZ3203的提取，NICE表达系统构建的质粒pNZ9530的提取，质粒pNZ3203和pNZ9530的导入，以及谷胱甘肽基因的诱导表达；步骤为：

(1)高效率乳杆菌电转化感受态的制备：

a)挑旧金山乳杆菌DSM20451^T单菌落接种到MMRS培养液中，30℃静置培养过夜；

b)2％v/v接种至20mL MMRS培养液中，30℃静置培养细胞OD₆₀₀至0.5-0.8；

c)培养物装至50mL预冷的无菌离心管中，5000rpm、5min离心去上清，收集菌体；

e)用与菌体等体积预冷的PEB-1洗涤菌体两次；

e)用200μL预冷的PEB-1重悬菌体，按每份40μL分装于5份1.5mL离心管中，保存于-80℃或直接转化；

(2)质粒pNZ3203的提取：

f)乳酸乳球菌NZ9000的培养：挑选含有插入了谷胱甘肽合成关键酶的基因gshA和gshB的质粒pNZ3203的乳酸乳球菌NZ9000单菌落接种到含有25μg/mL氯霉素的15mL GM17培养液中，30℃、200rpm培养过夜；

g)质粒pNZ3203的提取：合并步骤f)菌悬液100mL，用博大泰克公司生产的革兰氏阳性菌大量质粒提取试剂盒按使用说明提取质粒pNZ3203，并用200μL无菌水溶解质粒pNZ3203；

(3)质粒pNZ9530的提取：

h)乳酸乳球菌MG1363的培养：挑选含有插入了协助pNZ3203构成NICE表达系统的质粒pNZ9530的乳酸乳球菌MG1363单菌落接种到含有红霉素50μg/mL的15mL GM17培养液中，30℃、200rpm培养过夜；

i)质粒pNZ9530的提取：合并步骤h)菌悬液100mL，用博大泰克公司生产的革兰氏阳性菌大量质粒提取试剂盒按使用说明提取质粒pNZ9530，并用200μL无菌水溶解质粒pNZ9530；

(4)质粒pNZ3203和pNZ9530的导入：

j)取1μL质粒pNZ3203和1μL质粒pNZ9530与40μL的上述步骤e)所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，冰浴10min；

k)采用电穿孔仪进行电转化：电压1.75kV；电容25μF；电阻100Ω；

l)电击完毕向电转化杯中加入400μL添加了质量体积分数15％蔗糖的MRS培养液，转移至1.5mL的离心管中，30℃静置活化2-3h；

m)取步骤1)所得的培养液100μL涂布在含有25μg/mL氯霉素和50μg/mL红霉素的MMRS琼脂平板，30℃静置培养至菌落出现；

(5)谷胱甘肽基因的诱导表达：

n)将步骤m)所得单菌落接种到含有25μg/mL氯霉素和50μg/mL红霉素的MMRS培养液中，30℃静置活化2-3h；

o)在步骤n)所得培养液中添加终浓度为2ng/mL的nisin和5mmol/L的L-半胱氨酸，30℃培养36-48h，得到能在nisin诱导下自身产生谷胱甘肽的旧金山乳杆菌DSM20451^T基因工程菌菌悬液。