[发明专利]乙醇诊断/测定试剂(盒)及乙醇浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙醇诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定乙醇浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

乙醇具成瘾性，酒滥用和酒依赖是当今世界范围内最严重的社会经济和公共卫生问题之一。在西方国家，酒精相关性肝病已成为死亡的第六位原因。在我国，近20年来，随着社会经济发展，人均酒消耗量大幅度上升，酒依赖的患病率日趋增高。

生物样品中乙醇的定量测定方法主要有化学比色法，酶终点比色法，均相酶免疫测定法(EIA)，气相色谱法(GC)和呼出气乙醇分析。此外血清渗透量法可作乙醇半定量分析。

有多种化学比色法曾用于乙醇定量测定，微量扩散法是其中较简单实用的一种，微量溢出的乙醇可使铬酸还原成蓝色的氧化铬。

根据所用的试剂酶不同，乙醇的酶法测定分为二种：乙醇氧化酶法和乙醇脱氢酶法，与乙醇氧化酶法相比，乙醇脱氢酶法的专一性高，不会与甲醇和丙酮起催化反应。

一般认为气相色谱法可作为参考方法，尤其在准确性和精密度要求高的法医学乙醇测定中应用最广。GC法的独特优点在于特异、灵敏，且能同时分析多种挥发性醇类物质，如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和异丙醇。

其他乙醇的测定方法还有：均相酶免疫分析(Homogeneous enzymeimmunoassay)、渗透量法、呼出气乙醇分析法；用呼出气乙醇分析仪检测乙醇操作简单、快速，在交通执法部门应用较多。这类仪器中一种是根据红外光吸收原理设计的，该法测定的乙醇浓度与酶法测得的血乙醇浓度相关性很好。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用双倍酶循环扩增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乙醇浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乙醇诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行乙醇浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明乙醇浓度测定方法如下：

乙醇+辅酶酒精脱氢酶乙醛+还原型辅酶

乙醛+水过氧化氢酶乙醇+过氧化氢

过氧化氢+辅酶NAD(P)H氧化酶还原型辅酶+氧

这种方法应用酒精脱氢酶(alcohol dehydrogenase；EC 1.1.1.1)酶(偶)联过氧化氢酶(Catalase；EC 1.11.1.6)、NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC1.6.3.1)酶促反应连续监测法。酒精脱氢酶作为作用酶，功能为将乙醇酶解产生乙醛。过氧化氢酶作为循环酶：过氧化氢酶的酶促作用使乙醛再次变回乙醇，使乙醇不断地被重复循环利用。酒精脱氢酶与NAD(P)H氧化酶都作为显色酶，将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算出乙醇的浓度。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明乙醇诊断/测定试剂(盒)较为理想：

缓冲液                     100mmol/L

稳定剂                     500mmol/L

辅酶                       3mmol/L

酒精脱氢酶                 10000U/L

过氧化氢酶                 12000U/L

NAD(P)H氧化酶              12000U/L

本发明的乙醇诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、酒精脱氢酶、过氧化氢酶、NAD(P)H氧化酶。

试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶。

试剂2