[发明专利]腺苷脱氨酶诊断试剂(盒)及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂(盒)，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。

腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是：腺苷(白色结晶粉末)+水(H₂O)腺苷脱氨酶肌苷(Inosine)+氨离子(NH₄⁺)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用间接酶循环扩增法(IndirectEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明腺苷脱氨酶活性浓度测定方法如下：

腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨

氨+2水+6氧化型铁氧还蛋白铁氧还蛋白亚硝酸还原酶

亚硝酸+6还原型铁氧还蛋白

亚硝酸+3还原型辅酶亚硝酸还原酶氢氧化铵+3辅酶+水

这种方法应用腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase EC 3.5.4.4)酶(偶)联铁氧还蛋白亚硝酸还原酶(ferredoxin-nitrite reductase；EC 1.7.7.1)、亚硝酸还原酶(nitrite reductase；EC 1.7.1.4)酶促反应连续监测法。腺苷脱氨酶及铁氧还蛋白亚硝酸还原酶都作为作用酶，功能为将腺苷酶解产生氨，再生成亚硝酸。亚硝酸还原酶作为循环酶：亚硝酸还原酶的酶促作用使亚硝酸再次产生氨离子(氢氧化铵)，使氨可以不断的被重复循环利用。亚硝酸还原酶又作为显色酶，一次可以将三个还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为三个辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明腺苷脱氨酶诊断试剂较为理想：

缓冲液        100mmol/L

稳定剂        500mmol/L

还原型辅酶    0.25mmol/L

铁氧还蛋白亚硝酸还原酶    10000U/L

亚硝酸还原酶              10000U/L

腺苷                      5mmol/L

氧化型铁氧还蛋白          5mmol/L

本发明的腺苷脱氨酶诊断试剂(盒)可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、腺苷、氧化型铁氧还蛋白。

试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷、氧化型铁氧还蛋白。

试剂2

缓冲液、稳定剂、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶。

还原型辅酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、腺苷、氧化型铁氧还蛋白在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷、氧化型铁氧还蛋白。

试剂2