[发明专利]一种水产品中恩诺沙星残留的一步式免疫检测方法

权利要求书

1.一种水产品中恩诺沙星残留的一步式免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）首先利用生物免疫技术制备恩诺沙星特异性多克隆抗体：利用生物免疫技术免疫小鼠来制备恩诺沙星抗体，小鼠免疫后分离恩诺沙星抗血清，以30％－50％饱和度的硫酸铵沉淀粗纯后，进一步利用superdexTM75柱纯化；

（2）以制备的特异性抗体与辣根过氧化物酶结合形成酶标记抗体，所述酶标记抗体的制备：称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2mL新配的0.1M NaIO_４溶液，室温下避光搅拌20分钟；溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；取出后，加20μL 0.2M pH9.6碳酸盐缓冲液，使pH升高到9.0～9.6，然后立即加入溶解在1mL 0.01M碳酸盐缓冲液中的小鼠血清抗体10mg，室温避光轻轻搅拌2小时；加0.1mL新配的4mg/ml NaBH_４液，混匀，再置4℃搅拌反应2小时；在搅拌下逐滴加入等体积的50%饱和度的硫酸铵，4℃静置1小时；3000rpm 4℃离心30min，弃上清，沉淀物溶于1mL0.01M pH7.4的PBS中，所述PBS为含有0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液，对0.01M pH7.4 PBS透析，4℃过夜；次日取出后，10000rpm 4℃离心30分钟所得上清液即为酶结合物；

（3）以96孔聚苯乙烯板为固相载体，包被相应完全抗原并进行封闭处理；

（4）对待测样品中的恩诺沙星残留进行分离提取，具体如下：空白样品用电动匀浆机匀浆，准确称取5.0g匀浆后的样品，添加不同浓度的沙星标准品，加入5mL体积比1:1甲醇-PBS混合提取液，于高速均质机处理2min，4℃下以4000rpm离心10min，转移上清液；沉淀用同样方法重复处理一次，合并两次上清；上清液再次以4℃10000rpm离心10min，弃去沉淀；上清液过0.22μm微孔滤膜；

（5）将样品提取液、酶标记抗体液同时加入96孔板中，进行反应后利用酶标仪测定OD450值；

（6）同时以不含有待测物的提取液代替样品液作为阴性对照，以恩诺沙星标准品的梯度稀释液代替样品液建立标准曲线；

（7）样品与阴性对照进行比较，引起吸光值降低10%以上即判断为阳性样品，即含有待测药物残留，否则为阴性样品；并根据恩诺沙星标准品的梯度曲线进行回归分析测定待测样品中药物残留的浓度。