[发明专利]重组双歧杆菌hRV－VP4表达载体及其口服疫苗

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体及其口服疫苗。

背景技术

人A组轮状病毒(human rotavirus，hRV)是引起新生儿严重腹泻的主要病原体，约60％的严重腹泻由RV引起的，全球每年有大约50万的婴幼儿因感染RV而死亡，因此，WHO将RV疫苗的研究放在优先发展的位置s^[1]。

目前，RV疫苗研究的主要方向是人工重配减毒口服活疫苗，其中影响最大的为Wyeth-Ayerst公司生产的口服疫苗，但由于安全问题很快退出市场(商品名Rotashield？，1999年6月因接种者出现肠套叠而主动撤回^[1])。近2年又有RIX4414^[12-13]和RotaTeq^[14]相继进行了临床3期试验的报道。在中国，目前只有兰州生物制品所的羊轮状病毒株P[8]G10于1998年获准生产应用^[1]，这也是我国目前唯一获国家批准的RV疫苗，但据临床反映，其免疫效果并不理想。此外，第三军医大学吴玉章教授正在开展hRV/VP7转基因马铃薯疫苗的尝试，但离临床应用还有时日。象流感病毒一样，自然界轮状病毒不同株之间的基因组节段重配和基因内部突变引起RV的保护性抗原发生很高的变异，导致疫苗研究大大滞后于临床上流行病毒的变异，给疫苗研究带来很大的困难^[10]，因此，模拟病毒自然重配(reassortant)的规律发展RV疫苗是最合理和有效的策略。但RV重配株的构建与筛选工作难度很大，花费大，耗时长，而最终产品带有大量非免疫必需的活病毒成分，接种增殖后难免有一定的副作用如发热、腹泻、肠套叠等，Rotashield的败北就是最好的例子。但是，人工模拟病毒自然重配方式的疫苗发展思路和较理想的免疫保护效果，无疑为RV疫苗的研究指明了方向。但具体的模拟和重组方案要有全新的思维。用自然病毒重配研制减毒活疫苗的老路，一方面，无法克服减毒活疫苗毒力回复的安全性问题，以及减毒RV对HIV感染者等免疫缺陷患者的致命危险。另一方面，无论是Rotashield、RotaTeq还是RIX4414，都无法回避婴幼儿接种后疫苗增殖导致的肠套叠、发热、腹泻、呕吐等副作用，而且也很难及时获得符合临床预防要求的新变异株疫苗。因此，hRV疫苗的研制工作仍然任重而道远。

动物模型研究表明，用VP4的病毒样颗粒肌肉免疫小鼠，血液中虽然产生病毒特异性中和抗体，却对小鼠没有保护作用，只有通过粘膜免疫系统接种的RV疫苗才有免疫保护作用[1-6]。因此，最有效的RV疫苗必然是有能力刺激肠道产生消化道局部免疫的疫苗。由此决定了RV疫苗的最佳剂型可能是引起粘膜免疫的口服疫苗。

hRV基因工程载体疫苗就是利用载体系统表达病毒保护性抗原构建新型疫苗的一种模式，其优点是避免了病毒身的毒副作用，缺点是难以找到理想的载体菌(表达系统)，即使有表达，免疫原性也较弱。hRV的主要保护性抗原是病毒蛋白(Virus Protein)VP4和病毒蛋白VP7。VP4蛋白是hRV一个重要的外壳蛋白，为线型抗原，不需要糖基化，无论在原核表达系统(如大肠杆菌)还是真核表达系统(如腺病毒)中均能表达出有免疫原性的VP4抗原，实验证明，口服hRV疫苗后婴儿产生的抗VP4抗体要比抗VP7抗体多[1]。但天然病毒中VP4的含量非常低，要获得足以产生有效保护性免疫反应的抗原，只有通过基因工程疫苗表达VP4来实现。

更值得注意的是：以VP7分型(G血清型)的主要流行的hRV(G1-4)，如果以VP4(P血清型)分型，则G1、G3和G4都属于P1A型^[1]。亦即，VP4的保护范围要比VP7的保护范围广泛的多。据统计，在我国人群中流行的主要RV有：G1(P1A[8])占72.7％、G2(P1B[4])12.1％、G3(P1A[8])14.2％和G4(P1A[8])2.5％，可见，hRV流行株以P1A[8]血清行为主^[11]，占临床流行病毒株的89.4％。

目前，未见有单独把VP4作为亚单位侯选疫苗的报道。至于国内的王明忠等用pGEX-4T-2融合表达载体在大肠杆菌BL21中实现了hRV VP4蛋白的表达^[15]；孙茂盛等在大肠杆菌或腺病毒中表达的则是猴轮状病毒的VP4基因^[16-18]；孔华等则进行的是VP4的转基因植物试验，目前的研究均没有做到口服疫苗的程度。