[实用新型]一种检测犬恶丝虫的斑点酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型属犬类免疫抗体检测技术领域，涉及针对犬类感染犬恶丝虫的诊断及其检测试剂盒。

背景技术

在我国，犬恶丝虫感染动物的现象极为普遍，候洪烈等[中国病原生物学杂志，2007，2(1)：35-40]对辽宁丹东地区犬的感染情况调查显示，血清阳性感染率为28.5％。全国的绝大多数省份已经报道有犬恶丝虫病的存在，除犬猫外，狼、小熊猫、狐、狐尾猴、猩猩、黑猩猩等30多种野生动物和人均可以作为其终末宿主。值得注意的是，免疫力低下的人会被偶尔感染，第三期幼虫可以引起患者肺部及皮下出现结节，病人出现胸痛和咳嗽等症状。寄生虫学分类上犬恶丝虫属线虫类、双瓣科、恶丝属(Dirofilaria)的犬恶丝虫(D.immitis)，感染后寄生于感染者的右心室及肺动脉等处，引起食欲不振、循环障碍、贫血、慢性心内膜炎、右心室扩张、呼吸困难及痉挛性咳嗽等症状，严重时出现心力衰竭、便血、尿血、肝硬化和腹水等[杨光友.动物寄生虫病学[M].成都：四川科学技术出版社，2005：185-187]，称之谓犬恶丝虫病或称犬心丝虫病。目前，该病呈全球性分布，在热带和亚热带地区流行程度较高，流行时间比温带和寒带长，特别是在热带地区，该病几乎是全年流行，传播媒介为七十多种蚊虫。近几年在意大利、北美和澳大利亚的流行情况日趋严重。由于犬恶丝虫病的难根治性和广泛分布性，自六、七十年代以来，学者们对其进行了大量的研究工作。到目前为止，国内的资料主要是关于犬恶丝虫的生物学特性、流行病学调查及药物治疗等方面的报道；其检测仍停留在传统的一些方法上，比如虫检法，很少有关于免疫学方面的报道。随着免疫学和分子生物学技术的发展，我们研制了犬恶丝虫免疫抗体的测试试剂盒。

发明内容

本实用新型的目的在于克服上述技术领域中存在的不足，提供一种检测犬恶丝虫的斑点酶联免疫试剂盒，可快速有效的检测犬恶丝虫感染的抗体水平。从而为预防、诊断犬恶丝虫病奠定一个良好的基础。

实现本实用新型的目的的技术方案是这样的：

一种检测犬恶丝虫的斑点酶联免疫试剂盒，其特征是试剂盒内设置有诊断膜片2，酶标二抗3、犬恶丝虫病阴性对照血清4、犬恶丝虫病阳性对照血清5、底物溶液6、洗涤液7，所述包被原是犬恶丝虫抗原，所述诊断膜片2是包被有包被原的硝酸纤维素膜，以上液体均分装放于小瓶中并置于测试盒中。

所述犬恶丝虫抗原按照如下步骤制备：

(1)用磷酸缓冲液(PBS)清洗收集到的犬恶丝虫，清洗3次。(2)用玻璃研钵在冰浴上研磨，直到用显微镜检查无完整虫体组织。(3)然后将研磨好的犬恶丝虫组织匀浆倒入微量离心管(Eppendorf)管中，-20℃条件下反复冻融5次，4℃条件下10000转/分离心30分钟，取上清液。(4)将上清液无菌过滤0.22微米后作为可溶性抗原，并用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量合格后分装于小瓶中，-20℃条件下保存。

所述的诊断膜片2是按照如下步骤制备：

(1)在硝酸纤维素膜(NC)的光滑面将膜划成5×5毫米的小方块，(2)将硝酸纤维素膜(NC)在蒸馏水中浸泡20分钟，完全湿透后取出，室温晾干，备用；(3)用微量加样器在小格中央滴加犬恶丝虫抗原1微毫升，37℃下静置1小时；(4)将包被好的膜片浸入1％小牛血清白蛋白(BSA)封闭液中，37℃封闭50分钟；(5)将封闭好的膜片置洗涤液中泡洗3次，每次5分钟。置室温晾干，即为诊断膜2，并放入干燥的塑料袋中保存。

所述的酶标二抗3按照如下步骤制备：