[发明专利]含有高表达分泌胰岛素前体的融合蛋白、编码该融合蛋白的DNA和胰岛素的制备方法

权利要求书

1.DNA，该DNA编码融合蛋白，该融合蛋白是来自芽孢杆菌属(Bacillus)或短芽孢杆菌属(Brevibacillus)细菌的胞壁蛋白CWP之一的MWP的信号肽；含有来自芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌的CWP的5～7或12个氨基酸的前导肽；具有以下通式：(Asp、Leu或Gly)(Gly、Asn、Ser或Leu)(Asp、Ser或Pro)(Arg或Ala或无)Arg(SEQ ID NO.51或52)所示的氨基酸序列的连接肽；以及胰岛素前体的氨基酸序列按该顺序连接而成。

2.权利要求1所述的DNA，其中上述连接肽具有SEQ ID NO.1～6中任一项表示的氨基酸序列。

3.权利要求1或2所述的DNA，其中上述前导肽来自MWP。

4.权利要求1～3中任一项所述的DNA，其中上述胰岛素前体具有SEQ ID NO.8或9表示的氨基酸序列。

5.权利要求1～4中任一项所述的DNA，其中上述融合蛋白具有SEQ ID NO.10～18中任一项表示的氨基酸序列。

6.权利要求1～5中任一项所述的DNA，其中该DNA具有SEQID NO.19～27中任一项表示的核苷酸序列。

7.载体，该载体含有权利要求1～6中任一项所述的DNA。

8.权利要求7所述的载体，其中上述DNA与来自细菌的启动子序列的下游功能性连接。

9.权利要求8所述的载体，其中上述启动子来自芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌。

10.权利要求7～9中任一项所述的载体，该载体进一步含有编码蛋白质二硫键异构酶简称为PDI的DNA。

11.宿主细胞，该宿主细胞含有权利要求7～10中任一项所述的载体。

12.权利要求11所述的宿主细胞，其中上述宿主细胞是芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌。

13.权利要求12所述的宿主细胞，其中上述细菌是短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。

14.胰岛素的制备方法，该制备方法包含以下步骤：培养权利要求11～13中任一项所述的宿主细胞的步骤；由宿主细胞表达所需融合蛋白的步骤；将表达的多肽从细胞或培养基中回收的步骤。

15.权利要求14所述的方法，该方法进一步包含将回收的多肽进行酶解处理的步骤。

16.权利要求15所述的方法，其中上述酶解处理是通过胰蛋白酶进行的处理。

17.权利要求14～16中任一项所述的方法，该方法是从培养基中回收上述多肽。

18.融合蛋白，该融合蛋白具有SEQ ID NO.10～18中任一项表示的氨基酸序列。