[发明专利]用于生物大分子结晶的结晶装置和方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于生物大分子结晶的装置，以及一种以干燥后的筛选液作为添加剂来扩散生物大分子溶液的结晶方法及其应用。

背景技术

生物大分子结构的测定，对理解生物大分子的功能，与疾病的关系及药物设计等都有密切的关系。目前生物大分子结构研究方法中，以X-射线晶体衍射技术为主，可以用于任何可结晶的生物大分子，从而使生物大分子结晶技术成为生物大分子结构研究的重点。

利用X-射线晶体衍射分析生物大分子结构面临的两个主要困难是：提供足够量的生物大分子样品以及获得生长良好的可衍射三维晶体。前者可通过发展各种过表达系统加以解决；后者是获得高分辨率生物大分子晶体结构的瓶颈。  目前晶体培养已成为晶体结构分析的最关键性问题，其中筛选合适的结晶条件是晶体培养中至关重要且耗时的工作。

目前常用的生物大分子结晶方法有悬滴气相扩散法、坐滴气相扩散法、油覆Micro-batch方法等。悬滴气相扩散法是指在涂有密封材料(如凡士林)的玻璃片、塑料片或专用胶带上滴加待结晶的生物大分子溶液和结晶筛选溶液等，并倒扣在含有上述结晶筛选溶液的池液上。坐滴气相扩散法需要将待结晶的生物大分子溶液和结晶筛选溶液的混合液滴加在一个结晶单元内，并用专用塑料膜或胶带密封。

在美国专利申请US 6,656,267 B2中描述了一种蛋白质结晶方法。首先，提供一种包括多个结晶单元的高分子结晶板，每个结晶单元都包括适合接受平衡溶液的储液槽，位于靠近储液槽的支架并且该支架适用于作为至少之一的样滴支撑区域和用于结晶物质的临时的低温支撑区域，支架内的样滴储槽并且适于接受包括结晶物质的样滴；其次，将平衡溶液分配到储液槽中；接着，将多个高分子溶液小滴分配到样滴储槽中；然后，用覆盖物覆盖结晶单元；最后，通过蒸气扩散结晶可结晶的物质。

图1和图2分别描述了悬滴法和坐滴法结晶生物大分子的示意图。

图1为悬滴法的示意图。储槽中的用于生物大分子结晶筛选的溶液通常包含缓冲剂或沉淀剂等。生物大分子溶液的小液滴也包含按一定比例加入的相同的生物大分子结晶筛选溶液以及待结晶的生物大分子溶液，使得这些溶液中的诸如缓冲剂或沉淀剂的浓度低于储槽中的溶液，在密封后，使得各单元内通过储槽的溶液与小液滴两者之间的蒸汽扩散达到进行生物大分子结晶的动态平衡的内部环境。

图2为坐滴法的示意图。在这种方法中，将生物大分子小液滴置于储槽溶液上方的支架上，这与悬滴法是相反的。随着人们对生物大分子结晶过程认识的加深以及对各种试剂的大量尝试与组合，晶体筛选条件日益增多，以Hampton公司常用的筛选条件为例，Screen Kit I、II及Index，共194个筛选条件，其它常用来优化晶体的试剂盒也有几百个条件，其他公司或实验室可以提供的常用晶体筛选条件也有几百到上千种。对每一种蛋白可以进行成千种条件的筛选，但大量条件的“海选”是以大量时间及试剂的消耗为前提的，并且也需要更多的生物大分子样品，很多情况下大量生物大分子特别是膜蛋白的生产表达及纯化是非常困难的。

对于大多数实验室，晶体生长和筛选一般还是由手工操作完成，费时费力，如果进行微量操作结果常常不够准确，严重影响了结晶实验的可重复性及目前对于生物大分子结晶高通量、大规模化的要求。

在生物大分子结晶的初始阶段，关键步骤就是确定适当的沉淀剂及生物大分子溶液的初始浓度。原因是沉淀剂/生物大分子溶液浓度之间的关系对结晶成功与否有重要影响。如果两者比值过低，条件不能形成晶核；反之比值过高，条件过饱和则容易出现过多沉淀。在现有技术的生物大分子结晶方法中，采用的是液-液混和的形式，这种形式下，两种溶液混和速度过快，一旦浓度过高，立刻会出现无定形沉淀而无法确定生物大分子结晶的浓度条件。

发明内容

本发明提供一种用于生物大分子结晶的结晶装置以及将干燥后的筛选液作为添加剂来扩散生物大分子溶液的结晶方法。该结晶装置和方法在向结晶区域中滴加筛选液的过程可以由自动化机械或机器人来完成，速度快，精度高，筛选的范围广，干燥后的“筛选液”保存时间长，可以在需要的时候随时取用。该结晶装置和方法能够有效的控制生物大分子结晶的速度，以及有效的确定生物大分子结晶所需的浓度条件。

根据本发明的用于生物大分子结晶的结晶装置，该结晶装置包括至少一个结晶单元，该结晶单元包括至少一个滴加池液的池液区域以及至少一个滴加筛选液(通常为很少的量)和待结晶的生物大分子溶液的结晶区域，该结晶区域与该池液区域气体连通，在至少一个结晶区域内，留有干燥后的筛选液的固态物质。