[发明专利]包含乳蛋白的猪精子稀释培养基

说明书

本发明涉及在家畜人工授精的准备过程中提高和/或保持精细胞活力的方 法。人工授精(AI)在家畜繁殖和改善的哺乳动物繁殖中已经广泛地被接受。 与直接交配相比，AI提供了许多优点。例如，从单个雄性动物收集的精子可以 用于向多个雌性动物授精，从而减少了维持种群所需的雄性动物的数量。AI也 对繁殖给予更大的控制，这导致更大的繁殖率和更宽的且更有效率的基因或遗 传决定的特性的传播。为了得到人工授精的良好效果，从雄性动物收集的精子 首先在体外储存，然后对选择的雌性动物实施授精。因此，人工授精的繁殖成 功高度取决于在体外合理的长时间内精液令人满意的储存。

通常，用于人工授精的精子在使用合适的液体稀释培养基稀释之后再储存。 稀释培养基的种类和储存温度与稀释培养基中精细胞活力的提高和/或保持具 有密切的联系，因而也与其授精能力密切相关。所用精子的工艺要求可能按照 物种的不同而不同。牛授精要求相对低浓度的精细胞，并且合适的样品可以被 迅速冷冻并储存持久的时期而并不会负面影响样品的繁殖力。相反，猪精子不 能以这种方式处理，因为向雌性授精需要更多数量的精细胞和更大量的精液或 稀释精液。猪精液通常使用合适的液体稀释培养基进行稀释，并且冷却到约17 ℃的储存温度。培养基足以将样品的体积增加到其原始体积的约5至20倍，并 且提供养分和保护性物质以提高和/或保持精细胞的活力。因为精细胞的代谢不 能被充分地抑制，所以在精液储存仅几天之后，精细胞活力发生显著的丧失。 因此，在人工授精中，使用储存超过五天的稀释精液会面临低妊娠率的问题。 猪精子能够储存在相对短的时间内，对用于AI的猪精细胞的使用和分发产生了 相当大的限制。

本发明提供了包含猪精细胞液体稀群培养基的改善后的组合物。许多用于 提高和/或保持猪精细胞活力的特定的液体培养基制剂是已知的，或者在商业上 能够得到。一般地，稀释培养基制剂以固体形式(粉剂)提供，并且溶于水后 使用。在本领域中可以发现标准的制剂。例如，J.Gadea综述了关于在人工授 精过程中使用的猪精液稀释培养基的最新知识。讨论了有效的新鲜精液稀释培 养基的要求，并且比较了目前可以得到的稀释培养基(参见 http://www.engormix.com/semen_extenders_used_in_e_articles_87 POR-htm)。猪精细胞稀释培养基通常包含盐类、能量源(例如葡萄糖)、一种或 多种抗生素和至少一种缓冲剂(例如4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)) 以使得到的溶液具有6至7.5之间的pH值。额外的组分可能包括己二胺四乙酸 (EDTA)和牛血清清蛋白(BSA)。得到的物质的混合物，当溶于水时，将产生具 有220至380毫渗透分子之间的渗透压力的溶液。

牛血清清蛋白(BSA)是一种广泛地用于组合物中以提高和/或保持精细胞 活力的蛋白质。BSA稳定水溶液中的高分子，并且还广泛地用于细胞培养基。 BSA还结合许多有毒物质并且稳定稀释培养基的pH值。BSA的特性使它成为特 别适于提高和/或保持精细胞活力的保护性物质。然而，BSA的使用具有两个主 要缺点。首先，BSA是从牛血清中分离和提纯的。由于某些牛产品的使用，最值 得注意的是血液制品，与牛海绵状脑病(BSE)的发生有关，因此，它造成了潜 在的威胁。其次，BSA的分离和提纯是高成本方法，并且不能始终产生具有可靠 质量和性能的产品。因此，BSA的成本价格相对较高，并且构成了猪精细胞稀释 培养基成本的主要部分。迄今为止，在猪精细胞稀释培养基的应用中没有BSA 的良好的替代物。为AI工业提供更经济的并且更适合的BSA代替物是本发明的 主要目的。