[发明专利]处理培养的细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及处理培养的细胞(cultured cells)的方法，尤其是在组织工 程和细胞疗法应用中用于细胞操作或细胞递送的方法。

背景技术

再生医学是医疗科学领域内即将来临的新兴学科。再生医学中使用 许多方法和途径。它们可以粗略地分为四个方面：

在体外组织工程中，利用支架和细胞使组织在身体之外生长。工程 化组织随后植入患者以替换受损或缺损组织。

在体内组织工程中，将支架置于受损组织区域，目的是诱导细胞从 周围健康组织的生长以修复受损组织。

细胞疗法是基于将细胞，尤其是干细胞，递送至受损组织区域以恢 复组织功能。

有一些疗法利用生长因子，例如细胞因子和趋化因子，以内源性细 胞补充至受损组织区域。生长因子可以直接递送到感兴趣区，例如通过 注射。

细胞在体外组织工程和细胞疗法中都起着关键作用，其中首先从合 适的细胞源收集细胞，即从患者(自体细胞源)或从供体(异体细胞源)，和 随后经历几个不同步骤，直到它们最终导入患者而替换或修复受损组 织。尽管细胞疗法和组织工程前几年取得了巨大发展，但是基本并且必 需的步骤，例如分别在支架中进行的细胞操作、细胞生长或向内生长， 细胞分化，细胞递送和细胞停留(cell retainment)仍旧是疑难问题，并且 在再生医学变得适合临床上使用前需要进一步改进。

在体外组织工程中，细胞在结构基体(structural matrix)中被接种和 生长，为了在生物反应器中长出新的组织，在促进细胞生长和直接分化 的生物活性分子存在下。随后新生长的组织将被植入体内。在组织工程 技术现状下，不可能精确控制不同细胞类型在组织工程化产品中的三维 分布。很难控制细胞在三维结构中的向内生长。细胞接种到固体多孔支 架上典型地不产生均匀的均质的细胞分布。产生这个问题的基础是下述 事实：足够的孔径是细胞迁移入支架内部和允许营养成分和代谢物充分 扩散所需要的，而另一方面，极少数细胞保留在具有大开孔的高度多孔 结构中和高的表面/体积比对促进具有大量细胞的支架的种群来说是必 要的。控制干细胞或祖细胞在三维结构基体中在不同位置分化为不同的 细胞类型就更成为问题。然而控制不同细胞类型的三维分布对复杂组织 如完整器官的构建是必不可少的。此外，控制不同细胞类型的三维分布 是提供更大的组织工程化产品的血管形成所必不可少的。

作为使用预先制作的多孔支架的替换方案，在本领域已知将细胞包 封在水凝胶、光可聚合水凝胶和热可逆水凝胶中。这通常导致细胞均匀、 匀质的细胞分布，和凝胶的高溶胀状态允许营养成分和代谢物充分扩 散。然而，水凝胶缺乏骨组织(例如骨和软骨)工程化所需的机械稳定性。 再次，在一种凝胶中控制不同细胞类型的三维分布是很困难的。

(干)细胞疗法的基本原理是将(干)细胞导入受伤或疾病区域。新导入 的(干)细胞具有生长、分裂和分化的能力，和可以用与本地组织具有相 同或类似结构和功能的新形成的组织恢复受损部位。正在发展的细胞疗 法中的主要问题在于许多疗法需要大量过量的细胞的事实。通常，仅1％ 的注入的细胞被递送和/或保留在感兴趣区域并在第一周后存活。细胞价 格昂贵并且难以大量获得(耗费时间)。

因此，大量过量应用这些细胞是不希望的。更重要的是，不清楚注 入后过量细胞发生了什么。它们可能是有害的并形成例如癌症风险。

当单独的细胞或许多细胞被包封入小细胞载体或容器中时，很大程 度上能够克服上述问题。本领域已知在细胞培养中使用微载体。微载体 可以是固体(细胞仅附着到表面)或载体可以是多孔的(在内部截留细胞)。 典型的微载体是基于生物相容材料，例如胶原、羟基磷灰石、PGLA和 生物陶瓷。

微载体的使用通常限于细胞培养。已知只有少数报道在组织工程中 使用微载体。最近一篇论文报道了与用作可注入支架的光可聚合材料联 合的接种有成骨细胞的基于大孔明胶的微载体的用途，描述于Declercq H等.，Biomacromolecules 2005(6)，1608中。

其次，在WO 96/12510中，上皮细胞生长在固体微载体表面上，和 为了获得用于治疗烧伤伤口和愈合迟缓伤口的移植物，报道了在水凝 胶，例如甲基纤维素、藻酸盐(alginates)和琼脂糖中包含所述载体。