[发明专利]改良toll样受体5刺激活性的修饰的鞭毛蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及具有增强的toll样受体-5(下文称为“TLR5”)刺激活性的鞭 毛蛋白突变体，特别涉及由点突变TRL5激动剂鞭毛蛋白的某些氨基酸以增 强鞭毛蛋白的TLR5刺激活性而制备的鞭毛蛋白突变体。

背景技术

鞭毛是决定细菌运动性的重要结构元件，其通常由钩状体、基体和丝状 体所组成。已知鞭毛有助于游动或集群运动、细菌趋向性、病原微生物对宿 主细胞的粘附和生物膜的形成。形成鞭毛丝状体的亚基蛋白被称为鞭毛蛋 白，鞭毛蛋白规则地装配形成丝状体。Hayashi等公开了哺乳动物细胞中表 达的TLR5可识别革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的鞭毛蛋白而激活NF-κB (Hayashi F，Smith KD，Ozinsky A，Hawn TR，Yi EC，Goodlett DR，Eng JK， Akira S，Underhill DM，Aderem A：Nature 410：1099-1103，2001)。

Toll样受体(TLRs)是典型的“模式识别受体(PRRs)”，它识别存在 于病原体中的“病原体相关分子模式(PAMPs)”，且不仅在哺乳动物中发现 了该受体，还在昆虫和植物细胞的表面发现该受体。至今已发现十三种 TLRs，这积极地引导了对TLRs激动剂的研究(Akira S，Uematsu S，Takeuchi O： Cell 124(4)：783-801，2006)。

PRRs(例如TLRs)分布在宿主细胞的表面或细胞质中，在受到多种 PAMPs刺激之后，PRRs能诱导先天性免疫应答，而且调节适应性免疫应答。 因而，TLR激动剂可作为适合于开发多种免疫调节剂(尤其是疫苗佐剂)的 靶点。

在本文中，术语“疫苗佐剂”指在与疫苗共同给药时，可以增强、延长或 加速由疫苗抗原诱导的Ag-特异性免疫应答的物质。批准用于人体的疫苗佐 剂包括磷酸铝，氢氧化铝，和角鲨烯乳化剂。疫苗佐剂必须满足以下五个要 求中的至少一个：1)调节共刺激分子在抗原呈递细胞表面上的表达，诱导 抗原特异性T淋巴细胞应答，或免疫调控(例如调控细胞因子的分泌)；2) 抗原呈递；3)诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞应答；4)靶向作用；和5) 形成贮存。

理想的疫苗佐剂：1)必须是安全的；2)必须是在体内可生物降解的； 3)与抗原单独给药时相比，必须显示有效的预防性或治疗性免疫应答；4) 必须是经化学或生物验证的物质；5)优选在浓度低于抗原时起作用；和6) 必须具有长的半衰期，以便它们可以容易地用于商业或临床应用。

目前用作疫苗佐剂或可考虑用作疫苗佐剂的物质包括：1)矿物盐，例 如氢氧化铝凝胶；2)表面活性剂物质；3)细菌衍生的物质；4)细胞因子 或激素；5)聚阴离子；6)聚丙烯基；7)载体；8)含病毒的活体载体；和 9)赋形剂，例如矿物油脂质体。其中，目前正被活跃研究且受到很大关注 的蛋白衍生的疫苗佐剂包括霍乱弧菌(Vibrio cholerae)衍生的霍乱毒素(CT) 和大肠杆菌(Escherichia coli)衍生的不耐热毒素(LT)。据报导这些疫苗佐 剂诱导在粘膜区和血浆中产生抗原特异性抗体，并诱导B7-2在抗原呈递细 胞(APCs)表面的表达以刺激CD4+辅助T细胞的共刺激信号。但是，这些 佐剂是具有高肠毒性的外毒素，因而正在进行有关降低它们的毒性和增强它 们的佐剂活性的研究。