[发明专利]制备具有高α-2-抗血纤维蛋白溶酶活性的病毒灭活生物流体

说明书

本发明涉及聚氧乙烯(4-5)-对-叔-辛基酚或者聚氧乙烯(20)山梨 醇酐单油酸酯用于制备具有高α-2-抗血纤维蛋白溶酶活性(α2-AP)的 病毒灭活生物流体的用途。

人类和动物的血浆以及血浆组分在现代药物中扮演了重要的角色。 它们主要在出血事件、血栓形成事件、纤维蛋白溶解和感染事件中，或 者在特定临床情形下的手术之前对病人进行预防或预处理中用于输血。

人类或动物的血浆或血浆组分在应用时存在的一个主要缺点是，存 在传播血源性病毒的风险，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病 毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)和西尼罗河病毒(West Nile Virus)， 或者可能出现的病毒，例如严重急性呼吸系统综合征(SARS)病毒和禽流 感病毒，这些病毒都属于脂包膜病毒。病毒风险也同样存在于通过重组 哺乳动物细胞系和转基因动物而获得的产品中。

因此，已经研究出各种用于血浆和/或血浆组分和/或重组体产品中的 病毒灭活的方法，例如先用亚甲基蓝处理然后用可见光照射的方法，和 溶剂/去污剂或单独用溶剂处理的方法。例如，美国专利US 4,481,189和 4,540,573记载了使用有机溶剂去污剂组合物(S/D方法)或单独的溶剂将 包含在血浆和血浆产品或特意加进去的肝炎病毒或其它包膜的病毒的传 染性降低了数个数量级。

在适当的试剂浓度、温度和接触时间条件下，用溶剂/去污剂或单独 的溶剂可以有效分解具有与脂质相连的包膜蛋白的病毒，而其对敏感血 浆蛋白的分子结构式和生物活性所产生的影响基本上可以忽略。

现在，溶剂/去污剂(S/D)方法是市场上许多血浆和生物产品(源自哺 乳动物细胞或哺乳动物的重组体或转基因产品)进行病毒灭活处理的主 要方法，包括用于输血的血浆。其步骤主要包括，以相对于有机溶剂磷 酸三正丁酯(TnBP)和一种或多种去污剂的蛋白溶液重量的0.3-1wt.％ 将蛋白质溶液保温1至6小时，所述去污剂通常是吐温-80，Triton X-100， 或者脱氧胆酸钠。血浆或血浆产品在含有大量供体的大池中(100至5000 升，或更多)进行处理，因此需要巨大并昂贵的药物制造设备。

该处理保持了许多凝结因子和其它不稳定血浆蛋白的功能活性，并 对致病的脂质包膜血源性病毒具有极好的病毒灭活效果(Burnouf和 Radosevich，Blood Rev 2000，14：94-110)。

用于输血用的大型池SD(LP/SD)血浆在使用相对于生物流体重量 的1wt.％的TnBP和相对于生物流体重量1wt.％的Triton X-100{聚氧乙 烯(9-10)对-t-辛基酚；分子式为t-Oct-C₆H₄-(OCH₂CH₂)_x，x＝9-10}保温、 油萃取、离心分离、和疏水反应色谱处理后，所述疏水反应色谱例如是 记载在Horowitz B.等人，Blood 1992；79：826-31中的，仍具有低功能活 性的特定丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpins)，例如已经被Hellstern P.等 人.Vox Sang 1992；63：178-85和Mast AE，等人，Blood 1999；94：3922-7 证实的α2-抗纤维蛋白溶素(α2-AP或SERPINF2)，和已经被Mast AE， 等人，Blood 1999；94：3922-7证实的α-1-抗胰蛋白酶(α1-AT或 SERPINAl)。

Mast等人将α2-AP活性的损失归结于该蛋白天然构型转化为潜在 的或聚合的非活性体(Mast等人，Blood 1999，94，3922-7)。

α2-AP活性的损失经常被解释为是因为大规模进行的粗糙和费时的 工业生产步骤造成α2-AP变性，例如高速离心、或者是为了除去SD试 剂在疏水性材料上进行的血浆材料的色谱分离方法。

当LP/SD血浆用于肝移植时，低α2-AP活性被怀疑可能有助于造成 超纤维蛋白溶解，其显示了这种损耗具有潜在的临床意义(de Jonge等 人，Anesth Analg.2002，94：1127-1131)。

最近，本发明人开发了一种用于小型池血浆(MP/SD)的溶剂/去污剂 处理方法。该方法已经被记载在国际专利申请WO 2006/082115中，这种 方法是在密闭的袋系统中对少量血浆进行处理。