[发明专利]通过SPE-LC-MS-MS定量测定尿中的利塞膦酸盐

权利要求书

1.定量测定尿样中的利塞膦酸盐的方法，该方法包括：

a)将内标溶液加入至尿样中；

b)将尿样应用于Oasis HLB柱，其中柱已经用甲醇预处理；

c)用约1％(v/v)在水中的TEA和约1％(v/v)在甲醇中的甲酸洗涤柱；

d)在真空下，用包含约3mM EDTA的约60％(v/v)甲醇和约40％(v/v)水的混合物洗脱利塞膦酸盐至少一次；

e)将洗脱液蒸发并且用10％(v/v)甲醇和90％(v/v)0.05MNH₄Ac-NH₄OH缓冲液的混合物重建以提供利塞膦酸盐和内标的样品混合物；和

f)用LC-MS/MS系统分析样品混合物。

2.权利要求1的方法，其中尿样是小鼠或大鼠尿样。

3.权利要求1的方法，其中内标是脱氧利塞膦酸盐。

4.权利要求1的方法，其中内标是作为水溶液加入的脱氧利塞膦酸盐。

5.权利要求1的方法，其中内标是作为约10μg/mL水溶液加入的脱氧利塞膦酸盐。

6.权利要求1的方法，其中Oasis HLB柱是30mg Oasis HLB柱。

7.权利要求1的方法，其中尿样量为约0.4mL。

8.权利要求1的方法，其中柱已经用约1mL甲醇预处理。

9.权利要求1的方法，其中柱已经用约1mL甲醇、随后用约0.5mL1％(v/v)在水中的TEA预处理。

10.权利要求1的方法，其中柱用约0.5mL约1％(v/v)在水中的TEA和约0.5mL约1％(v/v)在甲醇中的甲酸洗涤。

11.权利要求1的方法，其中包含约3mM EDTA的约60％(v/v)甲醇和约40％(v/v)水的混合物的量为约1.5mL。

12.权利要求1的方法，其中利塞膦酸盐用约0.75mL包含约3mMEDTA的约60％(v/v)甲醇和约40％(v/v)水的混合物洗脱2次。

13.权利要求1的方法，其中10％(v/v)甲醇和90％(v/v)0.05MNH₄Ac-NH₄OH缓冲液的混合物的量为约100μL。

14.权利要求1的方法，其中内标是脱氧利塞膦酸盐，并且用LC-MS/MS系统分析样品混合物，包括通过HPLC在Inertsil Phenyl-3HPLC柱上通过用溶液A和溶液B的混合物梯度洗脱分离利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐，其中溶液A的量从约10％(v/v)增加至约95％(v/v)，并且其中溶液A是约90％(v/v)在水中的甲醇，并且溶液B是约10mM含2％(v/v)三乙胺的乙酸铵-乙酸缓冲液。

15.定量测定小鼠或大鼠尿样中的利塞膦酸盐的方法，该方法包括：

a)将约100μL约10μg/mL脱氧利塞膦酸盐水溶液加入至约0.4mL小鼠或大鼠尿样中；

b)将小鼠或大鼠尿样应用至30mg Oasis HLB柱上，其中柱已经用约1mL甲醇、随后用约0.5mL 1％(v/v)在水中的TEA预处理；

c)用约0.5mL 1％(v/v)在水中的TEA和约0.5mL 1％(v/v)在甲醇中的甲酸洗涤柱；

d)用约1.5mL包含约3mM EDTA的约60％(v/v)甲醇和约40％(v/v)水的混合物洗脱利塞膦酸盐；

e)蒸发洗脱液并且用约100μL约10％(v/v)甲醇和约90％(v/v)约0.05M NH₄Ac-NH₄OH缓冲液的混合物重建以提供利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐的样品混合物；和

f)用LC-MS/MS系统分析样品混合物，其中通过HPLC在InertsilPhenyl-3HPLC柱上通过用溶液A和溶液B的混合物梯度洗脱分离利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐，其中溶液A的量从约10％(v/v)增加至约95％(v/v)，并且其中溶液A是约90％(v/v)在水中的甲醇，并且溶液B是约10mM含2％(v/v)三乙胺的乙酸铵-乙酸缓冲液。

16.定量测定小鼠或大鼠尿样中的利塞膦酸盐的方法，该方法包括：

a)将约100μL约10μg/mL脱氧利塞膦酸盐水溶液加入至约0.4mL小鼠或大鼠尿样中；

b)将小鼠或大鼠尿样应用至30mg Oasis HLB柱上，其中柱已经用约1mL甲醇、随后用约0.5mL 1％(v/v)在水中的TEA预处理；

c)用约0.5mL 1％(v/v)在水中的TEA和约0.5mL 1％(v/v)在甲醇中的甲酸洗涤柱；

d)用约0.75mL包含约3mM EDTA的约60％(v/v)甲醇和约40％(v/v)水的混合物洗脱利塞膦酸盐2次；

e)蒸发洗脱液并且用约100μL约10％(v/v)甲醇和约90％(v/v)约0.05M NH₄Ac-NH₄OH缓冲液的混合物重建以提供利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐的样品混合物；和

f)用LC-MS/MS系统分析样品混合物，其中通过HPLC在InertsilPhenyl-3HPLC柱上通过用溶液A和溶液B的混合物梯度洗脱分离利塞膦酸盐和脱氧利塞膦酸盐，其中溶液A的量从约10％(v/v)增加至约95％(v/v)，并且其中溶液A是约90％(v/v)在水中的甲醇，并且溶液B是约10mM含2％(v/v)三乙胺的乙酸铵-乙酸缓冲液。