[发明专利]来自多药运出蛋白缺损株的转化株以及使用该转化株的微生物转化方法

说明书

相关申请的相互参照 

本申请主张2007年3月1日提出的日本特愿2007-50935号的优先权，其全部内容均作为公开特别援引到本说明书中。 

技术领域

本发明涉及在多药运出蛋白缺损的宿主中整合来自异种生物的基因而得到的转化株、以及使用该转化株进行的底物化合物的微生物转化方法。 

背景技术

通常制备化合物的方法例如有化学合成法和酶促合成法。为了制备可作为很多药物原料的化合物，高效率地进行原料化合物的区域特异性或立体特异性修饰，这是不可缺少的。关于这些反应，已知酶促合成法较为优异。 

但是，以酶作为实际应用的催化剂在工业规模中使用时，必须考虑酶本身所具有的本质上的极限。即，酶的寿命短以及催化作用中必须有辅酶的问题。目前在使用酶的制备工艺设计中，如何延长酶的寿命、使酶活性持续的问题受到了较多关注。在酶促合成法中使用的大部分的酶在其催化作用中必须有辅酶，例如在氧化还原的酶促反应中，必须有NADH等吡啶核苷酸。这些辅酶通常价格昂贵，因此进行工业规模的酶促反应时辅酶的添加在成本上存在较大的问题。 

作为为了克服这些酶促反应的极限的解决对策，建立了使用微生物、特别是大肠杆菌的细胞作为酶促反应场所的战略。即，通过将大肠杆菌用酶的基因转化，可以使目标酶在细胞内大量表达。这意味着可以在细胞内连续生产酶，只要细胞存活就可以维持酶活性。并且，通过细胞内的各种代谢反应，可以再生酶促反应所必需的辅酶。

将上述大肠杆菌的转化体在培养基中培养，使底物化合物与培养物接触，获得经修饰的该化合物，通过该“微生物转化”可以尝试生产可作为各种药物原料的化学物质。特别是使用由细胞色素P-450基因转化的大肠杆菌对疏水性或两亲性的化合物进行微生物转化的氧化反应在药物制备中很重要。 

细胞色素P-450基因所编码的细胞色素P-450酶(以下简称为P-450酶)是还原型、结合有一氧化碳、在450nm附近显示索雷吸收带(索雷带)的一组含血红素的蛋白质的总称。P-450酶与很多动植物组织、霉菌、酵母的微粒体、一部分动物组织的线粒体的内膜结合，除此之外在某种细菌、霉菌中以可溶性的形式存在。 

P-450酶具有各种底物特异性。是可以以各种各样的有机化合物作为底物的、显示异常广泛的底物特异性的酶，不过也存在只与比较有限种类的有机化合物反应的底物特异性非常严格的酶。有时还显示对反应部位的立体特异性(stereo-specificity)或区域特异性(regio-specificity)也优异的选择性。已知P-450酶的具体功能是通过催化单加氧反应，在表达该P-450酶的细胞内参与生物体内异物(异生素)的氢氧化、环氧化、去烷基化、脱氮等各种反应。 

特别是来自微生物的P-450酶的一部分实际上已应用于有用化合物的工业生产。代表性的例子之一是放射菌链霉菌(Streptomycescarbophilus)的P-450酶，将作为底物的密实菌素(compactin)6α位进行氢氧化，作为产物生成高血脂的治疗药物普伐他汀(参照非专利文献1)。并且利用放射菌自养假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)ATCC33795株的P-450酶，使维生素D₃的1α位和25位进行氢氧化，生产活性型维生素D₃的方法也已经得到实际应用。这些来自微生物的P-450酶与向其供给电子的电子传递系统(铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶)共轭才会催化其单加氧反应。 

使用上述来自微生物的细胞色素P-450酶的化合物的微生物转化可使用表达该酶的微生物的培养液或菌体来进行。也可以使用将编码来自微生物的P-450酶的基因导入到适合作为宿主的放射菌变青链霉菌(Streptomyces lividans)中、表达该酶活性的培养液。但是，由具有上述基因的放射菌进行的底物化合物的微生物转化，由于放射菌特有的性质，培养和底物化合物向目标产物的转化需要很长时间。为了有效增加酶的表达量还必须对诱导酶表达的条件进行研究。并且，有时转化所使用的放线菌中存在代谢或分解底物化合物或目标产物的反应体系，这引起副产物的生成或底物化合物和目标产物的减少等，成为目标产物的生产性能降低的一个原因。