[发明专利]专性异二聚体大范围核酸酶及其用途

权利要求书

1.一种专性异二聚体大范围核酸酶，其由第一和第二单体组成， 所述单体来自两种不同的同二聚化LAGLIDADG内切核酸酶单体(母 体单体)，并且具有至少一对突变引入到所述母体单体中使得各母体同 二聚化LAGLIDADG内切核酸酶的两个单体之间形成分子间相互作用 的对应残基上，其中所述突变对中的第一突变在所述第一单体中，所述 突变对中的第二突变在所述第二单体中，所述突变对破坏由各单体形成 功能性同二聚体，而不阻止形成能切割非回文杂合DNA靶标的功能性 异二聚体，所述非回文杂合DNA靶标包含被各自母体同二聚化内切核 酸酶切割的DNA靶标中不同的一半。

2.权利要求1的专性异二聚体大范围核酸酶，其中所述单体中的 第一单体和第二单体分别具有下述突变对中的至少一种：

a)8位上的谷氨酸被碱性氨基酸替换，7位上的赖氨酸被酸性氨基 酸替换，

b)61位上的谷氨酸被碱性氨基酸替换，96位上的赖氨酸被酸性氨 基酸替换，

c)97位上的亮氨酸被芳香族氨基酸替换，54位上的苯丙氨酸被小 氨基酸替换，以及

d)137位上的天冬氨酸被碱性氨基酸替换，51位上的精氨酸被酸 性氨基酸替换，

所述位置参照I-CreI氨基酸序列SEQ ID NO：1来表示。

3.权利要求2的专性异二聚体大范围核酸酶，其中如a)或b)中 所述，所述单体的8位或61位上的谷氨酸被碱性氨基酸替换，7位和 96位上的赖氨酸残基中的至少一个被精氨酸替换。

4.权利要求2的专性异二聚体大范围核酸酶，其中如c)中所述的 97位上的亮氨酸被芳香族氨基酸替换的单体还包含54位上的苯丙氨酸 被色氨酸替换。

5.权利要求2的专性异二聚体大范围核酸酶，其中，如c)中所述 的54位上的苯丙氨酸被小氨基酸替换的单体还包含58位上的亮氨酸或 57位上的赖氨酸被甲硫氨酸替换。

6.权利要求2的专性异二聚体大范围核酸酶，其中所述酸性氨基 酸是谷氨酸。

7.权利要求2或3的专性异二聚体大范围核酸酶，其中所述碱性氨 基酸是精氨酸。

8.权利要求2或4的专性异二聚体大范围核酸酶，其中所述芳香族 氨基酸是苯丙氨酸。

9.权利要求2或5的专性异二聚体大范围核酸酶，其中所述小氨基 酸是甘氨酸。

10.权利要求1-9中任一项的专性异二聚体大范围核酸酶，其由至 少具有突变D137R的第一单体和至少具有突变R51D的第二单体组成。

11.权利要求1-9中任一项的专性异二聚体大范围核酸酶，其包含 如权利要求2的a)、b)、c)或d)中所定义的至少两对突变。

12.权利要求11的专性异二聚体大范围核酸酶，其中一个单体的7 位和96位上的赖氨酸残基被酸性氨基酸替换，另一个单体的8位和61 位上的谷氨酸残基被碱性氨基酸替换。

13.权利要求11或12的专性异二聚体大范围核酸酶，其包含如权 利要求2的a)、b)和c)中所定义的3对突变。

14.权利要求13的专性异二聚体大范围核酸酶，其由第一单体和第 二单体组成，所述第一单体至少具有突变K7R、E8R、E61R、K96R和 L97F或者K7R、E8R、F54W、E61R、K96R和L97F，所述第二单体 至少具有突变K7E、F54G、L58M和K96E或者K7E、F54G、K57M 和K96E。

15.权利要求1-14中任一项的专性异二聚体大范围核酸酶，其由两 种I-CreI单体变体组成，其还包含I-CreI的26-40位以及44-77位的不 同突变。

16.权利要求15的专性异二聚体大范围核酸酶，其能切割来自目的基 因组序列的非回文杂合DNA靶标，所述目的基因组序列对应于被各母体 同二聚化内切核酸酶切割的DNA靶标中不同的一半。