[发明专利]在存在降低水平的一或多种污染物的条件下制备重组蛋白的细胞培养方法

权利要求书

1.富集细胞培养物中的重组蛋白的方法，所述方法包括：(a)将包含编码重组蛋白的核苷酸序列的第一核酸分子以及包含编码至少一种抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列的第二核酸分子导入细胞，其中两种核苷酸序列均可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件；和

(b)在使得所述重组蛋白在降低水平的一或多种污染物的存在下产生的条件下培养所述细胞，由此在细胞培养物中富集所述重组蛋白。

2.权利要求1的方法，还包括从细胞培养物收获所述重组蛋白的步骤。

3.权利要求2的方法，其中一或多种污染物的水平在收获步骤中是降低的。

4.权利要求1或3的方法，其中所述一或多种污染物选自：一或多种宿主细胞脂质，一或多种宿主细胞蛋白，一或多种宿主细胞碳水化合物，一或多种宿主细胞RNA分子和一或多种宿主细胞DNA分子。

5.权利要求4的方法，其中当重组蛋白和抗凋亡蛋白或其功能片段共表达时，一或多种污染物的水平相对于所述重组蛋白单独表达时产生的一或多种污染物的水平降低大约20％，或大约30％，或大约40％，或大约50％，或大约60％，或大约70％，或大约80％，或大约90％，或大约95％，或大约96％，或大约97％，或大约98％，或大约99％，或更多。

6.权利要求1的方法，其中所述第一核酸分子和第二核酸分子被克隆入同一载体。

7.权利要求1的方法，其中所述第一核酸分子和第二核酸分子被克隆入分离的载体。

8.权利要求6或7的方法，其中所述载体是质粒。

9.权利要求6或7的方法，其中所述载体是病毒载体。

10.权利要求1的方法，其中所述第二核酸分子在所述第一核酸分子之前导入。

11.权利要求1的方法，其中所述第一和第二核酸分子被同时导入。

12.权利要求1的方法，其中所述第一核酸分子包含两个核苷酸序列，每一个核苷酸序列编码重组蛋白，并且每一个核苷酸序列可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件。

13.权利要求1的方法，其中所述第一核酸分子还包括一或多个选自下组的核苷酸序列：(a)能增强翻译的核苷酸序列；(b)能增加分泌的核苷酸序列；和(c)能增加mRNA稳定性的核苷酸序列，其中(a)-(c)中的一或多个核苷酸序列可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列。

14.权利要求1的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

15.权利要求14的方法，其中所述哺乳动物细胞选自：BHK21细胞，CHO细胞，CHO-K1细胞，CHO-DUXX细胞，NSO细胞或Sp2/0细胞。

16.权利要求14的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。

17.权利要求1的方法，其中所述重组蛋白是治疗蛋白。

18.权利要求1的方法，其中所述重组蛋白是抗体或其抗原结合片段。

19.权利要求18的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

20.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件选自：(a)一或多种延伸的无甲基化GpG岛；(b)一或多种基质附着区；(c)一或多种稳定化区和抗阻遏区；以及(d)(a)-(c)的任意组合。

21.权利要求20的方法，其中一或多种延伸的无甲基化GpG岛来自一或多个遍在表达的基因的启动子区。

22.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是天然存在的DNA元件。

23.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是人工合成的DNA元件。

24.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是天然存在的DNA元件与人工合成的DNA元件的组合。