[发明专利]体外血液动力学的内皮/平滑肌细胞共培养模型在鉴定血管疾病的新型治疗靶标中的应用

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)主张2007年1月10日递交的美国临时专利申请No.60/879,710的优先权，其在此通过引用作为参考。关于资助研究或开发的声明

不适用。序列表的引用

不适用。

发明背景

发明领域

本发明通常涉及用于体外分析细胞(例如，内皮细胞)上流体流动(例如，血液动力学)的装置和方法。更具体地，本发明涉及使用允许在培养皿环境内物理分开一种以上的不同细胞类型，同时内部的细胞表面暴露于模拟的血液动力学流模式的装置的方法。

相关技术的说明

动脉粥样硬化是由动脉损害形成以及管腔变窄为特征的血管炎性疾病。内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)局部(regional)表型在血管疾病进展中具有显著的影响。早期动脉粥样化形成期间，内皮变得活化，导致粘附分子表达，对脂蛋白的通透性以及细胞因子产生的增加。此种环 境改变可以影响SMC以经历“表型转换”，该表型转换特征为形态的改变、提高的增殖和迁移、以及降低的确定的静止SMC标记的表达。

动脉粥样硬化进一步的特征为其在大动脉中于血液动力学上受限(defined)的区域处形成斑块，例如在产生复杂流动模式的分叉处形成斑块。对空斑形成敏感的倾向于动脉硬化的(Atheroprone)区域经受低时均(time averaged)剪切应力和“干扰的”振荡流模式。相反，对空斑形成不很敏感的防止动脉硬化的(atheroprotective)区域遭受相对较高的时均剪切应力和脉动层流(13，39)。血流长期受干扰的区域中，EC表型的变化，例如增加的粘附分子表达(即血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、e-选择蛋白)，和对于低密度脂蛋白(LDL)的穿内皮通透性，将影响局部信号环境并且可以改变SMC表型，导致动脉粥样硬化的增生、迁移和发病。

对于涉及EC和血液动力学流模式的控制SMC表型改变的因素并未全面理解。然而，动脉粥样硬化中SMC表型转换的标志是限定分化的SMC的收缩蛋白质的遏制，包括SMMHC、SMαA和myocardin。

为了理解动脉粥样化形成中剪切应力对内皮的作用，广泛地研究了将EC暴露于多种剪切应力条件的体外模型。由于EC可以辨别流模式中的变化并且对于剪切应力幅度和血液动力学的时间变化特征敏感，仿效体内流环境似乎对于概括内皮的体内表型具有更大影响。此外，很少有研究显示了在任何模式的流存在下，EC和SMC的复杂的相互作用和交叉通讯，并且目前尚无已知的调查关于内皮上的体内来源的人血液动力学力如何调控SMC表型转换的研究，所述转换正如典型地由文献所定义的。

发明概述

本发明的一方面涉及(但不限于)用于将在人体循环模型化后的血液动力学(即血流)模式施加于培养中的人类/动物细胞的体外生物机械模型。这一模型复现使用非侵入式磁共振成像从人体循环直接测量的并且翻译给控制椎台(cone)转动的马达的血液动力学流模式。椎台浸入流体(即细胞培养基)中并且达到非常接近平板表面上生长的细胞表面。椎台的转动将动量传递到流体上并且在平板或细胞表面产生依时间变化的剪切应力。该模型最接近地模拟了体内施加于内皮细胞(血管内衬的细胞)的生理血液动力学力并且克服了早前应用更简化的非生理流动模式的流动装置的局限性。

本发明的另一方面涉及结合市售可得的transwell的共培养皿，例如75mm直径的transwell。这允许在培养皿环境下物理分开两种、三种或更多种不同细胞类型，同时将内部的细胞表面暴露于模拟的血液动力学流模式。其他重要的改变包括流入和流出管道以向共培养模型的内和外室两者分别且独立地供给培养基、药物等。使用外部组件来控制生理温度和气体浓度。贴壁细胞通过人工transwell膜以及Petri皿的底部的物理分离允许分别地分离每个细胞层、或表面用于生物分析阵列(即蛋白质、基因等)。

本发明的直接应用包括1)研究人类/动物内皮和平滑肌细胞的交叉对话，这两种细胞是构成血管壁并参与动脉粥样硬化(心脏病、中风、外周血管疾病)和其他血管疾病的病理进展的两种关键细胞类型。2)这一模型也可用作诊断模型，检测新型基于药物的治疗的毒性、炎症(例如单核细胞粘附、炎性细胞因子释放、炎性基因诱导)和通透性。

涉及本发明的多种实施方案的一些示例性新方面包括但不限于下述(没有指定的顺序)：