[发明专利]环状染色体构象捕获（4C）

权利要求书

1.分析靶核苷酸序列与一个或多个目的核苷酸序列(如一个或多个基因 组基因座)相互作用的频率的方法，其包括以下步骤：

(a)提供交联DNA的样品；

(b)用第一限制酶消化交联的DNA；

(c)连接交联的核苷酸序列；

(d)解除交联；

(e)任选用第二限制酶消化核苷酸序列；

(f)任选将核苷酸组成已知的一个或多个DNA序列与在一个或多个目的 核苷酸序列侧翼的可用的第二限制酶消化位点连接；

(g)利用至少两个寡核苷酸引物扩增一个或多个目的核苷酸序列，其中每 个引物与目的核苷酸序列侧翼的DNA序列杂交；

(h)将扩增的序列与阵列杂交；并

(i)确定DNA序列间相互作用的频率。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)或(f)中的连接反应导致 DNA环的形成。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(h)包括用测序 方法(如高通量测序)分析靶序列和目的交联序列之间的连接产物。

4.根据前述权利要求之任一项分析两个或更多个靶核苷酸序列与一个 或多个目的核苷酸序列相互作用的频率的方法，其包括在步骤(g)中使用多重 PCR。

5.根据前述权利要求之任一项分析两个或更多个靶核苷酸序列与一个 或多个目的核苷酸序列相互作用的频率的方法，其包括在步骤(g)中为每个靶 序列汇集部分或全部获得的PCR产物并随后同时分析它们的DNA相互作 用。

6.根据权利要求5所述的方法，其中在汇集和通过与阵列杂交进行分析 之前将两个或更多个扩增的序列不同地标记。

7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中当两个或更多个扩增 的序列处在不同染色体上时将所述序列相同地标记并通过与阵列杂交进行 分析。

8.根据权利要求5所述的方法，其中当两个或更多个扩增的序列处在同 一染色体上足够远的距离从而使DNA-DNA相互作用信号之间的重叠最小 化时将所述序列相同地标记。

9.根据前述权利要求之任一项所述的方法，其中将高通量测序用于分析 靶序列与捕获的目的序列之间形成的连接接头。

10.根据权利要求9所述的方法，其中通过向扩增序列的末端添加测序 需要的衔接序列而将测序定向于靶序列与捕获的目的序列之间形成的连接 接头。

11.根据权利要求10所述的方法，其中通过向用于扩增一个或多个目的 核苷酸序列的寡核苷酸引物添加测序需要的完整或部分衔接序列作为5’突 出端而将测序定向于靶序列与捕获的目的序列之间形成的连接接头。

12.根据权利要求10所述的方法，其中通过将生物素物质或其它模块与 用以扩增一个或多个目的核苷酸序列的寡核苷酸引物缀合，随后是链霉抗生 物素蛋白或其它介导的对PCR扩增物质的纯化而将测序定向于靶序列与捕 获的目的序列之间形成的连接接头。

13.根据权利要求9到12之任一项所述的方法，其中通过设计用于扩增 在距所分析的第一和/或第二限制酶识别位点400、300、200、150、100、90、 8070、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1核苷酸内的 一个或多个目的核苷酸序列的寡核苷酸引物而将测序定向于靶序列与捕获 的目的序列之间的连接接头。

14.根据权利要求9到12之任一项所述的方法，其中通过设计用于扩增 一个或多个目的核苷酸序列的寡核苷酸引物从而使它们部分地或完全地与 所分析的第一和/或第二限制酶识别位点重叠而将测序定向于靶序列与捕获 的目的序列之间的连接接头。

15.根据权利要求9到14之任一项所述的方法，其中序列读过连接接头 从而当分析多重或汇集的PCR样品时，在连接接头的每一侧获得充分的序 列信息(例如12个核苷酸或更多)以明确地鉴定每个靶序列和每个捕获的目 的序列。