[发明专利]突变的G蛋白偶联受体及其选择方法

权利要求书

1.一种选择具有增加的构象稳定性的G-蛋白偶联受体(GPCR)的方法，该 方法包括

(a)提供一个或多个亲代GPCR突变体；

(b)选择配体，该配体是当GPCR位于特异构象中时结合亲代GPCR的配体；

(c)在变性条件下，通过测量由失去配体结合能力所证明的变性，确定相对 于亲代GPCR与该选定配体的结合的构象稳定性来说，突变的GPCR与该选定配 体的结合是否具有增强的构象稳定性；和

(d)选择那些相对于亲代GPCR与该选定配体的结合来说，具有增强的构象 稳定性的突变的GPCR，其中，存在于步骤(c)的GPCR中的构象对应于步骤(b) 中选定配体的类型。

2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)之前将一个或多个突变体与 所选配体接触。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中一个或多个突变体是以溶解的形式提 供的。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所选配体来自配体的激动剂种类并且该 特定构象是激动剂构象，或所选配体来自配体的拮抗剂种类并且该特定构象是拮 抗剂构象。

5.如权利要求4所述的方法，其中所选配体来自配体的激动剂种类并且在步 骤(c)中GPCR位于的特定构象是激动剂构象。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中对于所选配体，突变体的结合亲和力 与亲代对于所选配体的结合亲和力相比，是相同的或更大。

7.如权利要求1或2所述的方法，其中将该方法重复一轮或多轮，在步骤(a) 中所选的具有增加的构象稳定性突变体在后续轮次的方法中代表亲代GPCR。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中选择对于热、去污剂、离液试剂和 极端pH中的任一种或多种具有增加的稳定性的突变GPCR。

9.根据权利要求8所述的方法，其中选择具有增加的热稳定性的突变GPCR。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中配体是完全激动剂、部分激动剂、 反向激动剂、拮抗剂中的任一种。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中配体是与GPCR结合的多肽。

12.根据权利要求11所述的方法，其中多肽是以下任何一种：抗体、锚蛋白、 G蛋白、RGS蛋白、抑制蛋白、GPCR激酶、受体酪氨酸激酶、RAMP、NSF、GPCR、 NMDA受体亚基NR1或NR2a、或calcyon、纤维连接蛋白结构域骨架、或结合 GPCR的其片段或衍生物。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(b)中选择两种或多种配 体，每个的存在导致GPCR位于同样的特定构象中。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其中选择这样的突变GPCR：与亲代相 比，其配体结合具有降低的结合能力，所述配体是与步骤(b)中所选的配体不同 种类的配体。

15.根据权利要求1或2所述的方法，其中GPCR是β-肾上腺素受体、腺苷 受体和神经紧张肽受体中的任一种。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其中配体被可检测地标记。

17.根据权利要求16所述的方法，其中配体被荧光标记。

18.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(c)包括使用FRET。

19.一种制备突变GPCR的方法，该方法包括：

(a)实现权利要求1-18中的任一项的方法；

(b)鉴定所选的增加的构象稳定性的突变GPCR中突变的氨基酸残基的位置； 和

(c)合成在所鉴定的一个或多个位置上含有替换的氨基酸的突变GPCR。

20.根据权利要求19中所述的方法，其中与亲代GPCR相比，突变GPCR含 有多个突变。