[发明专利]表层嵌合体（surface chimera）转基因植物的培育方法

说明书

技术领域

本发明提供培育仅在一部分细胞中具有导入基因的嵌合基因重组植物的方法。

背景技术

由多个遗传上不同的细胞群组成的个体称作嵌合体。植物的嵌合体从其结构上可分为周缘嵌合体、部分嵌合体及扇形嵌合体，例如除嫁接外，可通过由突发的或放射线照射引起的体细胞突变、由药剂处理引起的染色体加倍来制备。

扇形嵌合体(sectorial chimera)是植物重叠结构引起的非结构性嵌合体，由生长点上非结构性混合存在的突变细胞的增殖所产生。即一个组织层自身即是嵌合体，多在花·叶·茎等的器官呈现不同颜色的条纹。扇形嵌合体通常不稳定、大多易消失，但也有极少发展成周缘嵌合体。

周缘嵌合体(periclinal chimera)是指由植物的组织层结构引起的结构性嵌合体，是扇形嵌合体发展、一个细胞层完全被突变细胞取代的状态。为周缘嵌合体时，一个组织层自身均匀，不是嵌合体。已知周缘嵌合体稳定，消失的几率小。植物的细胞组织基本上由3个细胞层构成，从外侧开始具有第1层(L1)、第2层(L2)、第3层(L3)的组织层结构。

由生长点的2层原套(tunica)产生的组织层为L1和L2，由原体(corpus)产生的组织层为L3。在几乎所有的植物种中，表皮均由L1层生成，L2层与生殖细胞系统有关。上述这些每个细胞层都具有不同性质的周缘嵌合体很多在园艺上都很重要、且产业价值高，但通过突发的方法、或通过放射线照射、药剂处理等人工诱变的方法得到周缘嵌合体的概率极低。

在将外源基因导入植物体时，人工培育出仅在一部分细胞中具有导入基因的嵌合体植物非常不容易。到目前为止，已有通过使用基因枪的方法向玉米的未成熟胚中导入基因，从而培育出仅在生殖细胞或L2细胞层中具有导入基因的嵌合体植物的例子(日本特表平10-503374号公报)。但是，通过农杆菌介导而导入基因时，培育嵌合体植物就更加困难。通过农杆菌介导而导入基因的方法中，以通过标记基因表达的抗药性等的性状为指标，筛选导入了基因的单一细胞，由该单一的基因导入细胞得到一个转化体植物个体。

因此，通常得到的基因重组植物由可遗传的单一细胞组成，是在所有的细胞中具有导入基因的植物。即使得到了仅在一部分细胞中具有外源基因的植物(嵌合体植物)，那也是偶然的结果，利用现代技术进行仅在植物体的特定部分的细胞中导入基因的控制非常困难。而且认为，即使是偶然所得，形成如前所述的仅在一部分细胞层中具有基因的周缘嵌合体的概率也极低。

在筛选基因导入细胞的过程中，有时虽出现仅在其一部分细胞中导入了外源基因的嵌合细胞团或嵌合植物体，但此时通过全细胞层形成嵌合体、或一个组织层自身形成嵌合体，而不是完整的周缘嵌合体(仅在特定的细胞层中导入了外源基因，其细胞层自身均匀)。至今为止，培育出完整的周缘嵌合体转基因植物、并将其用分子生物学的方法证明的例子极少。到目前为止，虽已报道了以下实例，即发现了通过使用含有rol基因和脱离因子的载体，可培育出周缘嵌合体(日本特开2002-315460号)，但此时为L3层的周缘嵌合体。

在基因重组植物中，被掺入染色体中的导入基因根据孟德尔定律可稳定传递给其后代。通过将这些基因重组植物作为杂交亲本使用，利用来自导入基因的性状进一步培育出新品种。

而且对于基因重组植物，担心的是其对生态系统(环境)的影响(导入基因向自然界的扩散等)。作为用于防止基因由基因重组植物向非转化体、野生植物扩散的技术，已知有(1)母系遗传的利用、(2)雄性不育的利用、(3)不育种子的利用等。母系遗传的利用是指通过在不传入花粉细胞的叶绿体的基因组中导入外源基因，从而防止通过花粉的基因扩散的方法。

雄性不育的利用是指或抑制花粉形成、或使花粉不具有生殖能力的方法，可由此进行遗传隔离。例如有使用雄性生殖器官特异性表达的启动子，组织特异性地制作有害的基因产物，从而抑制花粉形成的方法等。不育种子的利用是指通过直接抑制基因重组植物的种子形成，从而防止杂交或种子扩散这两者的方法，不能进行自留种的“终止子技术”等即为此方法。