[发明专利]抗幽门螺旋杆菌的新免疫球蛋白

说明书

发明领域

本发明涉及用于预防、治疗和诊断由幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)引起的感染的材料和方法。更具体地说，本发明涉及新的特异性抗体可变区，其衍生物和完全人免疫球蛋白Abba3，其显示对幽门螺旋杆菌表达的BabA抗原具有特异性活性，生产所述免疫球蛋白的方法，它们的分离和用途，例如检测由幽门螺旋杆菌引起的疾病。本发明还涉及治疗和预防幽门螺旋杆菌菌株引起的病理性感染的免疫疗法，即被动疫苗接种。

发明背景

幽门螺旋杆菌是革兰氏阴性细菌，定居在人胃粘膜，引起慢性胃炎，慢性胃炎可以发展为消化性溃疡和胃癌(6)。幽门螺旋杆菌在其表面表达粘附素，粘附素使得其与胃粘膜紧密粘附，以容许这些营养缺陷型生物从宿主组织获得营养。BabA粘附素是外膜蛋白平行同源家族的成员(2)，其与在上皮细胞上表达的岩藻糖基化ABO/Lewis b血型抗原结合(7，22)。

BabA是一种可能的疫苗候选物，因为临床分离物中高比例显示出表达BabA(22，26，33)。由于胃肠道中免疫活性低，抗幽门螺旋杆菌的主动疫苗接种很困难。一个其他问题是幽门螺旋杆菌的高重组率。被动免疫反而更有利，因为Abba3抗体与抗原结合，使得幽门螺旋杆菌难于附着于粘膜。

最近的研究也已经证明BabA表达与消化性溃疡和胃癌的发展之间有显著的关联(16，36)。现在，正在研究递送高度ABO/Lewis b岩藻糖基化糖缀合物进行被动免疫疗法的可能性(18，43)。做为选择，干扰粘膜粘附的抗体衍生物可以口服给予或由GRAS(GenerallyRecognised As Safe，公认安全的)微生物在原位产生，正如口服给予抗幽门螺旋杆菌的IgG(11，25)，或给予表达抗链球菌突变株的单链可变片段(scFv)的乳酸杆菌(30)所显示。scFv是一种由免疫球蛋白的可变重链(VH)和轻链(VL)通过灵活的肽接头连接组成的基因工程抗体。

胃中细菌不仅仅面临着宿主特定环境条件，而且要面对病变进展过程中粘膜糖基化模式的改变。尽管如此，幽门螺旋杆菌仍具有产生慢性和持续感染的卓越能力，这可能是由于它出奇高的重组率(15)。

幽门螺旋杆菌紧密粘附和不粘附之间转换的能力使得该细菌得到从炎症组织渗漏的营养物，但同时也使细菌暴露于宿主炎症反应(37)。

BabA通过以下方法有助于结合灵活性：富含CT的引导序列中基于移码的变异，与BabA密切相关的外膜蛋白(OMPs)在它的N-和C-末端区域但位于不同位点的babB和babC(4，5，40)的水平基因转移和基因转换。尽管BabA主要发现在babA位点中，但是与位于babB位点中的BabB的基因转换导致较弱BabB启动子控制下的全长BabA形成或产生BabA区别于BabB的独特区域上游重组位点的嵌合BabA/BabB基因(12)。在受感染猕猴和患者中，重组还可以引起babA位点内BabB的存在，及随后Lewis b结合的丧失(12，20，40)。第三个位点BabC，以前仅在26695菌株中描述过，最近在另外的菌株中也表明其涉及与BabA的重组交换。

等(5)已经表明已失去结合Lewis b能力的临床幽门螺旋杆菌分离株当中，一小部分细菌群隐匿BabB/BabA嵌合体，并且体外通过与磁珠包被的Lewis b淘选可以重建Lewis b结合。这将使细菌对宿主炎症反应时糖基化模式的改变产生应答。基因转换引起嵌合型BabA形成，但是CBD(碳水化合物结合结构域)突变将引起功能丧失并由此引起幽门螺旋杆菌急性传染期的存活率降低，其中血型抗原仍然在上皮细胞上高度表达。

恒河猴试验性感染末期，所分析菌株中babA位点中唯独babB的存在产生了抗原变异用来避免宿主免疫应答的假说(40)。在两份报道中测试了患者血清中幽门螺旋杆菌抗原的抗原性，但是因为在二维分离前，蛋白被尿素变性，检测构象依赖性膜蛋白的可能性颇受限制(19，27)。

用分离自包涵体的重组BabA(44)免疫兔子已经产生了多克隆抗BabA血清，并且在大多数菌株中显示出识别BabA。迄今为止，已经描述了两个单克隆BabA特异性scFv，其用BabA-GST融合蛋白免疫啮齿动物而产生，范围覆盖BabA-J99结构域的氨基酸128至310(21)。Western印迹分析所分析的菌株仅仅大约一半是阳性的，可能由于与多克隆血清相比单克隆抗体有更多限制表位。此外，对仅含一部分BabA，没有明确功能性构象的蛋白进行所描述scFv的噬菌体选择。