[发明专利]抗体多肽在C-末端的偶联

说明书

发明领域

本发明涉及蛋白质化学领域，特别是涉及抗体片段的二聚化。

发明背景

对两个独立的抗原具有亲合力的双特异性抗体，先前已有描述(由 Holliger和Winter 1993Curr.Opin.Biotech.4，446-449综述(也见Poljak， R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123；Cao等(1998)，Bioconjugate Chem. 9，635-644)；Aramwit等，未来的药物(Drugs ofthe Future)2005，30， 1013-1016；Moosmayer等Clin.Cancer Res.2006，12，5587-5595)。这 样的抗体可特别用于(除了别的以外)针对靶位，例如肿瘤的细胞毒性 剂或免疫效应器细胞的再定向(redirection)。迄今为止，已经通过采用 连接基连接两个独立抗体的VH和VL域建立了大多数双特异性抗体， 所述连接基太短以至于不能使各域之间在同一链上配对，因而驱使互 补的域之间在不同的链上配对，以再建立两个抗原-结合位点。这种类 型的抗体分子缺乏Fc域，并且因此缺乏抗体引发效应器功能的能力 (如补体激活，Fc-受体结合等)，并且由于其相对小的尺寸，半衰期通 常很短。双特异性抗体应该含具有不同特异性的至少两个抗体的抗原 -结合部分，并且两个部分均可经重组表达。例如，Albrecht等 (Bioconjugate Chem.2004，15，16-26.)描述了二聚化的ScFvs，其经二硫 代-连键而二聚化的。

已经用作两个生物分子的共价轭合的间隔基的双功能分子，已由 Li等描述(Bioorg.Med.Chem.Lett，2005，15，5558-5561)。然而，为了 双特异性抗体构成物的制备，使用无论哪一种方法，两个不同抗原- 结合部分的连接是制备中的关键问题。随机二聚化将导致难以分离的 许多不同偶联产物的混合物。用于控制相互反应的片段的连接的现有 的方法，为例如孔中的杵状结构(knob-in-hole)突变(Carter，J.Immunol. Methods 2001，248，7-15.)、亮氨酸拉链(leucine-zippers)(Kostelny，等J. Immunol.1992，148，1547-1553.)或寡核苷酸配对(oligonucleotide pairing)(Chaudri等FEBS Letters，1999，450，23-26.)。其中来自两个具 不同特异性的抗体的重链和轻链抗体可变域稠合在一起，作为一条单 一多肽链的构成物也已被描述(Kipriyanov和Le Gall，Current Opinion in Drug Discovery&Development，2004，7，233-242.)。为制备杂-二聚构 成物，主要的问题是控制哪几条单体将要形成二聚体。以作者的学识 认为，没有现成的方法，其中的二聚化过程是仅靠化学反应控制的。

因而，对改良的和替代的用于生产二聚化抗体构成物，例如，双 特异性抗体或其片段的方法存在需求，所述构成物是以商业上相应的 得率获得的并且经历纯化。

发明简述

为了克服以上提及的、用于使抗体片段二聚化的已知方法的局限 性，本发明现在提供用于使两个抗体片段在各自重链(HC)C-末端二聚 化的方法，该方法包括修饰C-末端和使C-末端反应，以形成两个抗 体片段间的共价键。本发明还提供含两个抗体片段的二聚体的化合 物，其中所述抗体片段在它们的重链(HC)多肽的C-末端偶联。本发明 还提供抗体片段，其中依据本发明对HC多肽的C-末端进行修饰。

依据由本发明提供的方法，一个抗体片段带有一个化学官能团， 其不出现在第二个抗体片段中，而第二个抗体片段带有另一个化学基 团，其不出现在第一个抗体片段中。当这两种化学基团相互反应导致 化学键时，可获得二聚化。

在具体的实施方案中，如在图1中概述的，抗体二聚化的片段是 Fab-片段，各自包含至少与轻链(LC)相关联的HC的可变域。然后， 连接HC多肽的C-末端以形成Fab2片段。

本发明的方法已经显示对以高得率和纯度产生二聚化的Fab-片段 是有用的，并且用于允许两个组成的Fab-片段以保留完整的N-末端。 类似的原则可应用于其它抗体片段在HC多肽的C-末端的二聚化过 程。