[发明专利]新型肽酶底物

说明书

本发明涉及用于检测肽酶活性的新型酶底物。这些底物可用于包括产生物理化学信号的酶水解步骤的应用，尤其用于微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等中。本发明还涉及含有该底物的反应介质、该底物或该介质在检测肽酶活性和/或区分革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌中的用途、以及使用方法。

当前存在非常多的检测微生物的介质。该检测可以尤其基于使用特别的底物，所述底物对需要检测的微生物酶具有特异性。通常而言，合成的酶底物由对待发现的酶活性具有特异性的第一部分和用作标签(通常为发色或荧光标记)的第二部分。因此，在细菌的情况下，取决于是否有反应来选择底物，可以表征微生物的性质。肽酶活性可以尤其用于发现一组、一种或一类细菌。因此，例如丙胺酸氨基肽酶可以区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

用于检测肽酶活性的发色的酶底物由现有技术已知。尤其可以提及Manafi发表的论文(Manafi等，Microbiol Rev 55(3)：335-348，1991)，这是一篇关于用于微生物学的酶底物的综述。然而，所述的氨基肽酶底物通过水解会释放在介质中扩散的化合物(β-萘基胺，7-氨基-4-甲基香豆素)。结果导致在多相反应介质(培养皿上的菌落、组织部分等)中，无法准确定位水解的位置。还可以提及在由本申请人提交的专利申请WO 98/04735和WO99/38995中描述的底物。然而，虽然这些底物不在培养介质中大量扩散，但是它们也具有一些缺点：它们难以合成，纯度低，产率低且它们对某些微生物有毒。

为此，本发明提出了用于检测微生物的新型肽酶底物。与现有的底物相比，这些新型的底物易于合成，且由于其形成一种不在反应介质中扩散的颜色而可以尤其用于胶体介质中以检测微生物。由此，可以从不显示肽酶活性的菌落或细胞器中，辨别显示肽酶活性的菌落或细胞器。

在对本发明进行描述之前，给出如下定义以方便本发明的公开。

术语“酶底物”用于指可以通过酶进行水解以形成产物，从而允许微生物细胞或细胞器的直接或间接检测的底物。该底物尤其包含对待发现的酶活性具有特异性的第一部分和用作标签的第二部分。

本发明的底物尤其适用于流式细胞术，这是因为水解产物主要保留在表达酶活性的细胞中，所以可以具体数出表达该活性的细胞或者甚至将其与其他样品分开。

本发明的底物还高度适用于组织酶学，这是因为水解产物主要保留在水解点上，所以可以具体识别出在组织中表达该活性的细胞或细胞器。

由于其具有低毒性，本发明的底物高度适于监测细胞培养肽酶的活性。

本发明的底物还非常适合用于检测和/或识别介质中，这是因为它们形成在反应介质中不扩散的颜色或荧光。在本申请中，术语“颜色”用于指颜色，其吸收可见光谱中的光或荧光，其在一个波长(λ_ex)吸收且在较高的波长(λ_em，λ_em＞λ_ex)发光。

本发明的底物可以成盐，即呈诸如为氯化物、溴化物、钾盐或三氟乙酸盐的盐的形式。

术语“肽酶”用于指能够通过水解而断裂出酰胺基的酶，其中所述酰胺基在肽酶的酰基残基和伯胺之间形成。术语“氨基肽酶”用于指能够通过水解而断裂出酰胺基的酶，其中所述酰胺基在氨基酸酰基和伯胺之间形成。在本申请中，术语“肽酶”在适当情况下可以指上述的肽酶以及氨基肽酶。

术语“肽”用于指包含1-10个氨基酸，优选1-4个氨基酸的肽键链。优选，所述肽为二-丙胺酸或三-丙胺酸。术语“氨基酸”用于指任何为本领域技术人员熟知的天然或非天然氨基酸。根据本发明的一个具体实施方案，氨基酸为β-丙胺酸或L-丙胺酸，或者为甘氨酸、焦谷氨酰等。

所述肽可以包含在其N末端上的封端剂。本发明的封端剂包含任何为本领域技术人员已知的能够保护胺的封端剂。例如可以提及叔丁氧基羰基(N-tBOC)、9-芴基氧羰基、助溶剂如琥珀酰，或者不可代谢的氨基酸，即非天然的氨基酸如哌可酸，或者氨基酸的D形式如D-苯基丙胺酸。所述封端剂并不系统地存在于本发明的化合物中。

术语“烷基”用于指基于饱和烃基团的链，尤其例如C₁-C₆烷基，即含有1-6个碳原子的直链或支链烷基。例如可以提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、异戊基及己基。