[发明专利]新型硝基还原酶底物

说明书

本发明涉及用于检测硝基还原酶活性的新型酶底物。这些底物可用于包括产生物理化学信号的酶水解步骤的应用，尤其用于微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等中。

当前存在非常多的检测微生物的介质。该检测可以尤其基于使用特别的底物，所述底物对需要检测的微生物酶具有特异性。通常而言，合成的酶底物由对待发现的酶活性具有特异性的第一部分和用作标签(通常为发色或荧光标记)的第二部分。因此，在细菌的情况下，取决于是否有反应来选择底物，可以表征微生物的性质。硝基还原酶活性可以尤其用于发现一组、一种或一类细菌。还可以用于监控微生物的还原新陈代谢，例如与其生长或抑制该生长相关的还原新陈代谢。

某些细菌还原硝基芳族化合物的能力为人所知已经许多年。Asnis(1957)报导了由大肠杆菌萃取物中分离能够还原对硝基苯甲酸的黄素蛋白。自从该报导之后，在多种生物体中已经鉴别出硝基芳基还原酶活性。这包括严格的需氧微生物，例如假单胞菌(Won等，1974)和诺卡氏菌(Villanueva，1964)，严格的厌氧微生物，例如梭菌(Ancermaier和Simon，1983)和韦荣氏球菌(McCormick等，1976)，或者真菌类(Masuda和Ozaki，1993)以及真核寄生虫(Douch，1975)。存在着据认为能够通过细菌硝基芳基还原酶而被还原的大范围的底物。它们尤其为硝基芳族化合物，例如对硝基苯甲酸、对硝基苯酚、对硝基苯胺及2，4，6-三硝基甲苯(McCormick等，1976)。

通常而言，硝基还原酶的酶活性的检测是通过间接的方法，例如通过监控底物或辅助因子的消失而进行。例如，Kitamura等(1983)研究了对硝基苯甲酸甲酯及一系列其他的硝基芳族化合物与大肠杆菌萃取物的还原。然而，该方法并不非常灵敏且不适合用于在多相介质中进行检测。还可以提及申请WO 00/28073，其描述了基于硝基香豆素的荧光底物用于直接检测硝基芳基还原酶的活性。该类硝基芳族化合物能够在还原后形成高度荧光的化合物，因而易于被检测。然而，该底物并不适合用于在多相介质中的检测。

因而，本发明建议改进用于检测微生物的硝基还原酶底物。与现有的底物相比，这些新型的底物易于合成且由于其形成一种不在反应介质中扩散的颜色而可以尤其用于在胶体介质中以检测微生物。

在对本发明进行描述之前，给出如下定义以便于本发明的公开。

术语“酶底物”用于指可以通过酶进行水解以形成产物，从而允许微生物细胞或细胞器的直接或间接检测的底物。在硝基还原酶底物的情况下，该底物尤其包含硝酸盐官能团，其通过待发现的酶活性而被部分或全部还原，该硝基官能团的还原改变使分子的某些物理化学性质，使该还原反应得以跟踪。

本发明的底物尤其适用于流式细胞术(flow cytometry)，这是因为还原产物主要保留在表达酶活性的细胞中，所以可以具体数出表达该活性的细胞或甚至将其与其他样品分开。

本发明的底物还适用于组织酶学，这是因为还原产物主要保留在还原点上，所以可以具体识别出在组织中表达该活性的细胞或细胞器。

由于其具有低毒性，本发明的底物适于检测细胞培养硝基还原酶活性。

本发明的底物还非常适合用于检测和/或识别介质中，这是因为他们形成在反应介质中不扩散的颜色或荧光。在本申请中，术语“颜色”包括可见光谱中的颜色，其吸收可见光谱中的光或荧光，其在一个波长(λ_ex)吸收且在较高的波长(λ_em)发光。

本发明的底物可以成盐，即呈诸如为氯化物、溴化物、钾盐或三氟乙酸盐的盐的形式。

术语“硝基还原酶”用于指可以完全或部分还原NO₂基团的酶。

术语“烷基”用于指基于饱和烃基团的链，尤其例如C₁-C₆烷基，即含有1-6个碳原子的直链或支链烷基。例如可以提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、异戊基及己基。

术语“芳基”用于指由芳环衍生的官能团(或取代基)，例如C₆-C₁₀芳环，尤其为苯基、苄基、1-萘基或2-萘基。