[发明专利]微芯片大容量PCR与集成实时CE检测

说明书

优先权信息

本申请要求2007年6月11日提交的美国临时专利申请60/943,248 号的优先权，其内容以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及用于进行大容量聚合酶链反应(PCR)和集成毛细管电 泳(CE)检测的微流控装置。

背景技术

通常将微流控PCR定义为尺寸极小的，例如500至0.5μm范围内的 腔室中的PCR。存在具有各种加热体系的微流控系统，例如区域加热、 外热器、集成电阻、焦耳加热和红外辐射，不过这些加热体系要求外部 检测。这意味着在反应结束时，必须用物理方法将一部分样品从PCR腔 室中移出，并通过诸如凝胶电泳或毛细管电泳等手段在系统外部进行分 析。该类型的操作的实例记载于Cheng等，Nucleic Acids Res，24(2)，p. 380-385(1996)；Kopp和Manz，Science，280(5366)p.1046-8(1998)；Oda Anal Chem，70(20)，p.4361-4368(1998)；和Chen等，Anal Chem，77(2)：p. 658-666(2005)中。要求外部检测的体系与实时检测功能不相容，这是因 为这样的体系需要移出大部分的PCR反应溶液用于外部测定。

其他的检测方法使用光学检测，这涉及嵌入染料如SYBR Green(参 见Rasmussen等，Biochemica，1998(2)：p.8-111998)，或荧光探针如Taqman 探针(参见Kalinina，O.等，Nucleic Acids Res，25(10)，p.1999-2004(1997)； Belgrader，P.等，Science，284(5413)，p.449-450(1999)；Belgrader，P.等， Anal Chem，75(14)，p.3446-3450(2003)；和Northrup，M.A.等，Anal Chem， 70(5)，p.918-922(1998))。SYBR Green染料是高特异性的双链DNA结合 染料，用于检测在PCR循环中积聚的DNA产物。尽管这些检测方法均 可用于实时PCR扩增，但是嵌入染料与Taqman探针技术之间的区别在 于嵌入颜料检测方法不具有特异性。它将检测所有的双链DNA，包括非 特异性PCR产物如引物-二聚物形式。鉴于此，使用嵌入染料的PCR扩 增往往需要熔解曲线分析以区分所需的PCR产物和非特异性PCR扩增。

相反，Taqman探针PCR检测方法具有高度的特异性，因为荧光信号 的产生取决于探针和所需的PCR产物之间的特异性杂交。不过，与SYBR Green染料不同，Taqman探针PCR检测方法需要合成分别用于不同系列 的探针，受到可用于探针标记的荧光染料局限性的限制(例如，受到不 同颜色的染料的数目的限制)，并且需要昂贵的试剂。

PCR的替代性检测方法是进行反应产物的电泳法DNA尺寸分离。该 方法使得所需的反应产物与所有其他来源的DNA或污染物分离而被鉴 别。许多具有外部检测的微流控PCR系统涉及DNA大小筛分，或者通 过凝胶，或者利用毛细管电泳，因为其具有特异性而且不需要靶标特异 性探针的合成。

发明内容

提供一种用于核酸扩增和检测的微流控系统。所述系统包括具有用 于扩增核酸的量的腔室的基板；布置在所述基板上的孔；连接所述基板 中的所述孔与所述腔室以允许溶液流过所述腔室的流道；和一个或多个 设置在所述基板并与所述腔室连接以用于分离检测所述腔室中的扩增的 所述核酸的一部分的分离通道。将所述腔室、所述流道和所述一个或多 个分离通道构造成使所述腔室和所述流道组合的流体流动阻力比所述一 个或多个分离通道中的流体流动阻力小约10³倍或更多，或小约10³倍～ 约10⁹倍，或小约10³倍～约10⁷倍，或小约10⁴倍～约10⁶倍。术语流体 流动阻力或水力流动阻力表示对于压力驱动性流动的阻力，可定义为压 差除以流率的比率。所述系统还可包括热循环装置或其他部件以进行分 离。