[发明专利]酶电极和酶传感器

说明书

发明领域

本发明涉及酶电极和使用该酶电极的酶传感器。

发明背景

已知酶传感器是利用酶优异的底物特异性对多组分样品(例如环境或 生物样品)中存在的特定组分(目标物质)的量进行高精确定量的方法。例 如，在临床科学领域中，研究并开发了用于酶传感器的酶电极，其能够选 择性地检测葡萄糖、尿素或尿酸等。由于酶具有高底物特异性，其能够选 择性地与样品中的目标物质(底物)反应，而不需要对待检测样品进行复杂 的预处理。

通常，酶电极包括电极和固定有酶的膜。使用酶电极的酶传感器能够 例如通过电化学检测物质的变化(即通过使用电极测量电信号的改变量)， 测量与酶具有特异作用的底物的浓度，所述物质通过样品中的目标物质与 酶的反应而产生。 例如，使用通过将固定有酶的膜(固定有葡萄糖氧化酶)连接到隔膜电 极(diaphragm electrode)上而制备的酶电极的酶传感器(葡萄糖传感器)能够 通过监测电极活性物质而测量生物底物的浓度，所述电极活性物质例如通 过酶反应得到的过氧化氢溶液(底物+O₂-(酶)→产物+H₂O₂)和由此 消耗的氧气。

为了提高酶传感器的检测灵敏度和检测效率，已经将酶固定在使用酶 电极的酶传感器的各种载体上。通常，已知的将酶固定在酶电极的方法有： 酶与具有两个或多个官能团的试剂反应的交联法；酶(蛋白)与不溶性载体 结合的载体结合法；包埋法，例如将酶包埋在凝胶的精细晶格中的固定式 包埋法(immobilization-by-entrapment method)和用半透明聚合物膜涂布酶 的微胶囊法(microcapsule method)；和物理吸附法等。

在上述方法中，交联法由于其固定时操作简单容易而被广泛使用。所 述交联法包括用交联剂(例如戊二醛)在酶之间形成交联从而将酶组合在一 起并由此固定酶的方法，以及加入基质物质(例如白蛋白)从而在酶和基质 物质间形成交联并由此将酶和基质物质固定的方法。

然而，由于这些交联法通过共价键进行交联，酶的活性常常降低，因 此在多种情况下不能获得足够的稳定性。此外，由于各个酶的交联方式不 同，且固定过程中需要多个反应和精炼操作，这些方法具有复杂、成本高 和通用性低的问题。 另外，在利用这些交联法的酶电极中，由于交联使酶间的空间变小， 因此物质的传递和扩散性往往较差。因此，所述酶电极存在灵敏度低、可 重复性差和使用寿命较短的问题。

在载体结合法中，由于该方法通过共价键直接将酶固定到树脂等物质 上，酶不易释放。然而，还存在如下问题：其固定操作复杂、酶通过蛋白 水解酶而分解和酶的立体结构根据外部环境的变化而变化。

在诸如固定式包埋法和微胶囊法等的包埋法中，由于凝胶晶格的大小 或者内-胶囊的大小常常与酶的大小不相配，用于固定的酶不能被牢固地固 定在凝胶晶格或胶囊中，从而使酶外泄并失活。此外，由于凝胶晶格或胶 囊的结构稳定性不足，包埋法在防止由于外部环境的改变引起的酶立体结 构的变化方面的作用极小。

因此，利用载体结合法或包埋法的酶电极缺乏稳定性。由于酶立体结 构随外部环境的变化而变化，且固定的酶的活性即使在测量过程中也会随 时间降低。因此，使用所述酶电极的酶传感器也具有可重复性差和使用寿 命较短等问题。

对于物理吸附法，提出了例如在二维基板上有序地形成介孔材料，然 后通过物理吸附将酶固定在介孔材料中的方法。(例如，参见以下专利文献 1和2。)

然而，由于介孔材料的细孔(细孔的内直径)大小往往与酶的大小(酶的 直径)不匹配，所述将酶固定在介孔材料中的方法不能使用于固定的酶被牢 固地固定在细孔内。由此，产生酶活性降低和酶的立体结构随外部环境的 改变而改变等问题。 因此，利用将酶固定在介孔材料中的方法制备的酶电极缺乏稳定性， 并且，使用所述酶电极的酶传感器也存在可重复性差和使用寿命较短的问 题。 专利文献1：日本专利申请特开2002-346999 专利文献2：日本专利申请特开2005-061961

发明内容

本发明要解决的问题