[发明专利]用于表达肠产毒性大肠杆菌定居因子(CF)抗原的杂合操纵子

说明书

本发明涉及用于表达肠产毒性大肠杆菌(Escherichia coli)定居因子(CF) 抗原的杂合操纵子，尤其涉及重组操纵子，其包括包含至少两个用于表达 两种不同CF的结构基因的基因。本发明还涉及在细胞基因组或插入细胞的 质粒中包括这种操纵子的宿主细胞，如大肠杆菌细胞。

发明背景

在世界许多地方的流行性地区，肠产毒性大肠杆菌(ETEC)是旅行者 腹泻、痢疾发病和儿童死亡率的主要原因。细菌的毒力与菌毛定居因子(CF) 的表达有关(Gaastra和Svennerholm，1996)，所述菌毛定居因子介导细菌与 肠的粘附以及热不稳定(LT)和/或热稳定(ST)毒素的分泌，所述毒素通过影 响肠中电解质和液体运输过程造成以腹泻为特征的疾病(Qadri等人，2005a； Sanchez和Holmgren，2005)。

ETEC疾病的预防与LT的抗体介导中和以及抗CF的免疫应答有关 (Levine等人，1994，Svennerholm和Holmgren，1995；Svennerholm和Savarino， 2004)。通常，疫苗的目的是在接受者中诱导免疫应答，所述免疫应答提供 对真实病原体后续攻击的预防。这可以通过接种病原体的活减毒株(即毒力 减弱的株)实现，这样的话它不引起疾病但仍然刺激有效的免疫应答，或通 过施用病原体的一种或多种能够引发有效抗感染毒性株的保护性免疫应答 的灭活株。对于抗肠道感染的免疫，疫苗优选通过口服途径以便在肠粘膜 局部有效地刺激有效的免疫应答，但是其他粘膜途径或肠胃外或甚至经皮 途径也可以用于诱导保护性免疫。

开发一种能够预防ETEC引起的疾病的有效疫苗是困难的。超过100 种不同的血清型与致病株有关。此外，这些株可能载有大量CF中的一种或 多种(其中每种是抗原性不同的)，其促进感染在肠中的发生(Qadri等人， 2005a)。

很多证据证明针对CF的免疫应答是保护性的，肠中的粘膜免疫应答对 保护是特别重要的(Svennerholm等人，1988，1990；Levine等人，1994； Svennerholm和Savarino，2004)。为诱导这类应答，优选口服施用ETEC疫 苗。我们之前已经开发了口服的全细胞灭活ETEC疫苗，其含代表常见 ETEC血清型的5种株并表达数种最常见的CF(在几种情况下通常称为coli 表面[CS]蛋白)，即CFA/I，CS1，CS2，CS3，CS4和CS5以及重组霍乱菌毒素 B亚基(CTB，其与ETEC LT的B亚基高度同源)(Svennerholm和Holmgren， 1995；Svennerholm和Savarino，2004)。利用该疫苗的初期临床试验在瑞典志 愿者，随后在埃及和孟加拉国的成人和儿童中引起显著的抗CTB和疫苗中 存在的特异CF的免疫应答(Jertborn等人，1993；等人，1998；Savarino 等人，1998，1999，Qadri等人，2005a，2005b)。该疫苗还提供对腹泻的有效预 防，所述腹泻严重到足以干扰将要去墨西哥和危地马拉的美国旅行者的日 常活动(Sack等人，2002；Svennerholm和Savarino 2004)。但是，在6-18个 月埃及婴儿中发现该疫苗的保护效力是低的(Savarino等人，待发表)。这表明 尽管该疫苗有效的抵御旅行者更加严重的疾病，但它不足以有效保护生活 在流行性地区的婴儿(Svennerholm和Steele，2004)。

所述ETEC疫苗在婴儿中低效的一个原因被认为归因于在这个年龄组 中发现的对CF抗原较弱的低抗体应答(Savarino和Svennerholm，2004)。这 种弱的应答可以通过给予更高剂量的不同CF来改进，因此增加疫苗剂量中 这些抗原的量是继续开发灭活ETEC全细胞疫苗优先考虑的。它不是简单 的在施用每个疫苗剂量时增加ETEC细菌的量，因为已经显示给6-18个月 的幼儿施用大量灭活大肠杆菌细菌(甚至大肠杆菌K12安慰剂制品)可能 导致以呕吐形式出现的不良反应，可能归因于大量内毒素(LPS)。如果给 予较低(低4倍)剂量的细菌，则观察不到这些不利作用(Qadri等人2005b， Savarino等人，待出版)。