[发明专利]Pitman moore狂犬病病毒株对原代鸡胚成纤维细胞培养物的适应方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗领域，尤其是，涉及将Pitman moore狂犬病病毒株(PM株)适应于纯化的鸡胚成纤维细胞培养物以用于生产改良且高度纯化的疫苗。具体而言，该适应的PM狂犬病病毒株产生高病毒效价，并且按照每颗蛋的疫苗剂量计算能够得到较高产量且具有高度免疫原性。 

背景技术

狂犬病是一种动物源性病毒疾病，可感染家养和野生动物。一旦出现该疾病症状，狂犬病对动物和人均是致死性的。然而，如果在暴露于病毒前或暴露于病毒后用狂犬病疫苗对个体进行免疫接种，并用消毒剂与抗狂犬病的抗体彻底清洗创口，该个体通常可得到良好的保护。人狂犬病疫苗由灭活或减毒的狂犬病疫苗制备，且自巴斯德时期至今已经过了成功的改良。由巴斯德研制的最初的狂犬病疫苗是基于神经组织的，且病毒通过干燥而灭活，但由于存在神经组织或髓磷脂(myelin)，该疫苗具有激活该病毒和发生过敏性反应的风险。Fuezalida等人引入了由新生小鼠脑制备的无髓磷脂疫苗(Vaccines：第四版，第37章，Plotkin，Rupprecht and Koprowski)。 

随后，研制了用于狂犬病的鸭胚疫苗(DEV)。用于狂犬病的DEV由在胚胎化鸭蛋中繁殖的病毒而制备。其免疫原性比脑组织疫 苗要差。因此，对于DEV而言，推荐每天接种14-23次，而且有时在严重暴露后，如此高的剂量也不能保护个体免受狂犬病侵袭。(Vaccines：第四版，第37章，第1018页，Plotkin，Rupprecht andKoprowski)。另一个与DEV相关的缺陷是它也含有髓磷脂相关蛋白，可引起副反应，因此后来被WHO禁用。因此，长久以来一直需要免疫原性较高并以低剂量且安全有效地应用的，既可用于初次免疫也可用于暴露后治疗的狂犬病毒疫苗。这些疫苗还能够大大降低接种后反应的次数和严重性。 

由于组织/细胞培养疫苗的研制而满足了这种需求。与前面所说的病毒的脑培养疫苗相比，细胞培养疫苗由于不存在神经组织，因此不仅更加安全而且更加有效。为了获得较高的免疫原性和安全性，现在已经开发了几种基于细胞培养的疫苗，如纯化鸭胚疫苗(PDEV)、第一代疫苗如人二倍体细胞疫苗(Wiktor et al.，1964.J.Immunol.93：353-366)and 2^nd generation vaccines like Purified ChickEmbryo Cell Vaccine(PCECV)，Purified Vero Cell Rabies Vaccine，Rabies Vaccine Adsorbed(RVA)，and Primary Hamster Kidney CellVaccine(PHKCV)etc.(Ref：JIACM 2006；7(1)：39-46)。 

上述疫苗研制成功的技术进展包括使Pitman moore狂犬病病毒株适应于连续细胞系如Vero细胞(如，纯化的Vero细胞狂犬病疫苗-Abhayrab^TM&Verorab^TM)和MRC-5人双倍体培养细胞系[如印度的人双倍体细胞疫苗(HDCV)-MIRV-HDC][Ref：JIACM 2006；7(1)：39-46]或鸭胚中原位进行适应(如，纯化的鸭胚疫苗-PEDV-Lyssavac N)。(Ref：Laboratory Techniques in Rabies；FourthEdition，Edi.by F.X.Meslin，M.M.Kaplan&H.Koprowski，WHOGeneva-1996)。 

Vero和MRC-5细胞系都是连续细胞系，因此有必要检测终产品中的细胞残留DNA(Ref.欧洲药典，2004)，因为其可能具有传 递潜伏病毒和其他物质的风险。而且，即使采用PM株制备疫苗，通过Vero细胞得到的产量实际上也比较低。PDEV是一种混悬疫苗，因此该疫苗无法用于皮内(ID)应用。此外，该技术获得的产量较低(每颗蛋1.8-2.2剂量)。处理时间也太长，需要88天。且市售PDEV疫苗采用防腐性硫柳汞，其可能与幼童自闭症有关系(Ref：http://www.ncirs.usyd.edu.au/facts/f-thiomersal.html)。另外，生产PDEV的过程长而繁琐，而且由于其产量低，因此不适于大规模生产。可以认为HDCV是金标准疫苗，但其太过昂贵。因此，需要提供一种改良的高免疫原性狂犬病疫苗，其能提供较高产量，而且利用基于细胞培养的技术，花费也不会那么昂贵。