[发明专利]检测琥珀酰丙酮

说明书

对相关申请的交叉参考

本申请要求2007年5月4日提交的美国申请11/744,789的优先权，将 其内容全部引入本申请作为参考。

背景技术

质谱法用于检测和测量宽范围的代谢物，所述代谢物的存在或量可以 指示某些病症或疾病。由此，质谱法可用于例如诊断与代谢物水平改变相 关的多种代谢性疾病(metabolic disorder)。一种所述代谢性疾病为I型遗传性 高酪氨酸血症(hereditary tyrosinemia，Type I，HT1))，其是由延胡索酰乙酰乙 酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase，FAH))的缺乏引起的，并且与酪氨酸 和琥珀酰丙酮水平增加相关。HT1是儿童期疾病，其引起肝衰竭、疼痛性 神经性危象(painful neurological crises)、佝偻病(ricket)和肝癌 (hepatocarcinoma)。若未经治疗，通常在不到2岁时发生死亡，一些慢性形 式允许生存到12岁。如果在生命早期开始治疗，则目前可能用NTBC(或尼 替西农)治疗HT1。由此，存在的主要动机是，通过新生儿筛查或甚至产前 筛查来鉴别HT1感染的患者。

发明内容

琥珀酰丙酮(Succinylacetone)是早期检测HT1的主要标志物。然而，琥 珀酰丙酮是非常具有反应性的酮，其与蛋白质形成缀合物。本申请所述的 方法能够用于在以下条件下从试样中提取琥珀酰丙酮，所述条件允许同时 提取其它代谢物，如氨基酸、游离肉毒碱或酰基肉毒碱。例如，可避免苛 刻的提取条件(如极端酸性和高温)。

本申请所述的方法可用于使用质谱法(例如串联质谱法)检测和/或测 量琥珀酰丙酮和一种或多种额外的生物分析物。所述方法用于诊断代谢性 疾病如氨基酸病(amino acidopathy)(例如，I型酪氨酸血症)，以及用于产生 所述疾病的检测/诊断的代谢分布。

在一个方面，本公开提供了提取的方法。所述方法包括以下步骤：使 试样与提取溶液接触，所述提取溶液包含C1-3直链或支链一元醇和强碱， 其中使试样与提取溶液接触从试样中产生了包含以下成分的提取物：(i)衍 生化的琥珀酰丙酮，(ii)一种或多种氨基酸，(iii)游离肉毒碱，(iv)一种或多 种酰基肉毒碱，或(v)(ii)、(iii)或(iv)的任何衍生化形式，其中衍生化的琥珀 酰丙酮在提取物中的浓度反映了琥珀酰丙酮在试样中的浓度，其中一种或 多种氨基酸、游离肉毒碱、一种或多种酰基肉毒碱或它们的衍生化形式在 提取物中的浓度反映了它们在试样中的相应浓度。所述方法还可包括在使 试样与提取溶液接触后，利用串联质谱法对试样进行分析的步骤。所述接 触可将至少一种琥珀酰丙酮分子衍生为3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸 (MPP)。所述C1-3直链或支链一元醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。 所述强碱可以是肼、修饰的肼(例如，酰肼、芳基肼、烷基肼、Girard-P和 Girard-T试剂)或羟胺。

在一些实施方案中，所述试样可以是生物试样如干燥过的血斑(blood spot)。所述试样可获自新生人类。所述试样可以是获自不疑患有代谢性疾 病如I型酪氨酸血症或面临发展所述疾病危险的受试者的试样。

在一些实施方案中，所述提取溶液可含有水、有机酸和/或一种或多种 内标物。例如，所述提取溶液可含有约5％至约30％水或约20％至约25％水。 所述有机酸可以是例如，浓度为约5mM的草酸。所述内标物可包括至少一 种重原子同位素如²H、¹⁵N或¹³C。一种或多种内标物可以是或含有琥珀酰 丙酮、氨基酸、游离肉毒碱、酰基肉毒碱或上述任何物质的衍生化形式。

在一些实施方案中，所述方法可包括以下步骤：在使试样与提取溶液 接触后，对试样进行蒸发，得到第一次蒸发的试样。所述方法还可包括以 下步骤：对试样进行蒸发后，使第一次蒸发的试样与烷基醇溶液接触，所 述烷基醇溶液包含烷基醇和酸。所述方法还可包括以下步骤：使试样与烷 基醇溶液接触后，蒸发溶液，得到第二次蒸发的溶液，和/或重组(reconstitute) 第二次蒸发的溶液。重组第二次蒸发的溶液可包括使第二次蒸发的溶液与 溶剂接触。所述烷基醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁 醇或戊醇。所述酸可以是盐酸(HCl)。所述溶剂可包括乙腈、异丙醇，或水 与异丙醇或与乙腈的混合物。