[发明专利]使用包含同位素编码的子标签和同量异序子标签的标签的蛋白质标记

说明书

发明领域

本发明公开内容的目的是提供通过质谱途径用于生物标志物和分 子靶点(molecular targets)的蛋白质组广度筛选(proteome-wide screening) 的技术解决方案。

在此呈现的基本思想是提供一种方法，其允许通过LC-MS(与质谱 法偶联的液相色谱法)平行筛选至少多达8个单独样品来在高数量的样 品中寻找与疾病相关的生物分子。

这通过所建立的同位素和同量异序肽标记过程和合适的实验设计 的组合来实现。所研究的肽的同位素标签化允许在MS的水平上快速筛 选两个疾病组之间的表达差异，而肽的同量异序标签化容许在MS/MS 的水平上所述两个所研究的组的不同独立成员的相对定量。进一步的， MS/MS研究的MS信号的数据依赖性选择显著地提高了处理量，因为 MS/MS研究的数量被集中到潜在的疾病相关生物分子上。

特别地，本发明的主题是新的同位素和同量异序标记的分子、包含 它们的试剂盒以及在质谱法中使用它们的方法。

发明背景

蛋白质分离技术

2D-GE(二维凝胶电泳)

来自高度复杂的混合物的蛋白质的分析和鉴定需要巨大的分辨能 力。存在着两种不同的方法。它们包括二维凝胶电泳(2D-GE)和(二 维)液相色谱(2D-LC)。2D-GE在分辨率上是非常卓越的(＞5000种 蛋白质)，但是受到缺乏自动化和重现性的困扰。此外，某些蛋白质例 如疏水膜蛋白、碱性和酸性蛋白、以及非常大的或非常小的蛋白质的分 辨很差。由于许多有前途的疾病标志物表现出这样的性质，2D-LC提供 了用于复杂蛋白质混合物的高分辨率分离的良好备选方案(Hanash，S. 等(2003)，Nature，422，226-232；Lipton M.S.等(2002)，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，99，11049-11054)。高分辨率2D-GE在1975年提出 (Klose J.(1975)，Humangenetik，26，231-243；O′Farrell P.H.(1975)， J.Biol.Chem.，250.4007-40021)。过程的第一维(等电聚焦)对分子 电荷极其敏感，第二维(SDS电泳)对多肽长度敏感，2D-GE在显示遗 传性变型(其约三分之一在净电荷方面与野生型不同)、蛋白水解裂解 和唾液酸含量的改变方面非常有效。它已经在过去十年间作为蛋白质组 和生物标志物分析的工具被广泛使用(Wittke，S.等(2004)，J.Chromat. B.，803，17-26)。

2D-LC(二维液相色谱法)

2D-LC方法比2D-GE更适合于分离较小的蛋白质，自动化的可能性 以及处理量显著地更好。已经描述了通过液相色谱法分离蛋白质/肽消化 物的几种技术，包括毛细管电泳(CE)(Kasicka，V.(1999)，Electroph.， 20，3084-3105)、反相(RP)-HPLC和二维液相色谱法。通常，对于 蛋白酶消化的样品的二维LC分离，组合强阳离子交换(SCX，第一维) 和反相HPLC(第二维)色谱法(E.等(2003)，J.Chromatogr. A.，1009，197-205)来分辨超过1000种蛋白质的样品(Ross P.L.等(2004)， Molec.Cell.Proteomics，3(12)，1154-69)。

二维液相色谱法技术提供了纯化和分析策略的灵活性(Washburn M.P.等(2001)，Nat.Biotechnol.，19(3)，242-47；Peng J.等(2003)， J.Proteome Res.，2，43-50)。2D-LC的LC部分一般使用与反相毛细管 紧接的离子交换柱(通常，强阳离子交换，SCX)，以一系列的循环来 运行。在每个循环中，盐浓度在离子交换柱中提高，以根据肽的等电点 将它们洗脱到反相系统中。在所述循环的接下来的部分，提高RP-HPLC 中的疏水条件，以实现最大的肽分离分辨。