[发明专利]抗毒素不稳定化技术

说明书

要求优先权

本申请要求2007年7月12号提交的美国临时申请号60/959,399 的优先权，该临时申请所公开的内容通过引用将其全部并入本文。

关于序列表的声明

随本申请提交了书面形式和计算机可读形式的在本文中所示的氨 基酸序列的序列表。所附序列表没出超出在提交的国际申请中公开的 内容。计算机可读形式中记录的信息与与其相关的书面形式的序列表 相同。

发明背景

细菌通常配置有所谓毒素-抗毒素(TA)或“自杀”基因系统，其 被认为在生长调节、细胞死亡和应激条件下的休眠中发挥重要作用。 在正常的生长条件下，毒素与从相同操纵子编码的其同源抗毒素形成 稳定的复合物(TA“复合物”)，从而毒素丧失作用于其细胞靶标的 能力。然而，在应激条件下，不稳定的抗毒素随着胞质内游离毒素的 伴随释放而被迅速降解，所述游离毒素随后将其毒性作用施加在特定 的细胞靶标上。

存在于细菌基因组上的毒素或自杀基因的数量变化很大；大肠杆 菌(Escherichia coli)一般包含6个独立的TA操纵子，每一个编码 一对抗毒素及其同源毒素，而结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)包含大约40个这样的操纵子。至今已经测序的所有治 病细菌基因组实际上包含1个或更多个TA操纵子，除了与宿主细胞专 性生长的细菌例如衣原体和支原体以外。在大肠杆菌的6个TA操纵子 中，3个已经被很好的表征；ReIE是一个核糖体相关因子，其刺激核 糖体内切核糖核酸酶活性，MazF和ChpBK以序列特异性内切核糖核酸 酶(所谓mRNA interferase(MIase))发挥作用。已经证明MazF当被 诱导时，在ACA序列处切割细胞mRNA从而有效抑制细胞蛋白质合成及 因此的细胞生长。MazF与其抗毒素MazE形成稳定的复合物，并且已 经测定了MazF-MazE复合物的X射线结构。因为TA复合物对细胞没有 毒性，所以其在大肠杆菌中得以很好的表达并很容易以非常高的产率 纯化。最近，ReIE-ReIB和YoeB-YefM复合物的X射线结构也已经被 测定，揭示了毒素和抗毒素如何在TA复合物中相互作用。

大多数细菌在其基因组内包含一定数量的毒素或“自杀”基因。 重要的是，从这些基因产生的毒素既不旨在杀死其定居处的其他细菌， 也不杀死感染过程中的动物细胞。相反，它们在细胞内产生并对本身 有毒性。在该新领域中的最新进展已经提供了关于这些毒素在细菌生 理学、多重抗药性的持续、致病性、生物膜形成和进化中作用的许多 迷人的观点。现在很明显的是，对这些毒素的研究在感染性疾病和医 疗科学中有非常重要的意义。因为这些毒素中的大多数与操纵子中的 其同源抗毒素共转录(因此称为毒素-抗毒素或TA操纵子)，并且它 们在正常生长条件下的细胞内形成稳定的复合物，这些毒素的毒性作 用一般不产生作用(Bayles，2003；Engelberg-Kulka et al.，2004； Hayes，2003；Rice and Baytes，2003)。然而，因为抗毒素的稳定 性比其同源毒素的稳定性低的多，所以引起细胞损害或生长抑制的任 何应激条件都影响细胞中毒素和抗毒素之间的平衡，导致细胞中毒素 的释放。尽管存在很大的争议，但最合理的是认为从TA操纵子编码的 这些毒素取决于应激条件的性质而以2种不同方式发挥功能。1种是 通过抑制特定的细胞功能例如DNA复制和蛋白质合成来调节生长速 率。在广泛的应激条件下，毒素的量超过抗毒素，细胞生长可能完全 被停滞。TA毒素在生长调节中的这种作用似乎是其主要功能。然而， 其第2种作用是自杀性的，即杀死其自己的宿主细胞。在特定的条件 下，TA毒素可以发挥作用以消除被高度损害的细胞(例如DNA损害或 噬菌体感染)以维持健康的群落。TA操纵子也经常出现在质粒中，其 在杀死细胞分裂后丢失质粒的细胞方面发挥作用；是一种称为分离后 杀死(post-segregational killing)。因此，TA毒素主要是抑制细 菌的，而不是杀细菌的(Gerdes et al.，2005)，但在特定条件下， 细胞可以达到无法恢复的地步而导致细胞死亡(Amitai et al.， 2004)。最近，Engelberg-Kulka认为大肠杆菌毒素Ma zF不是细胞死 亡的执行者，而是激活下游系统的调控者(Engelberg-Kulka et al.， 2005)。