[发明专利]突变型DNA聚合酶及相关方法

权利要求书

1.DNA聚合酶，其包括A-G-X₁-X₂-F-X₃-X₄-X₅-S-X₆-X₇-Q-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-L-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅(SEQ ID NO：33)，其中

X₂，X₅，X₆，X₉，和X₁₀是任何氨基酸，

X₁是H，E或Q，

X₃是N或H，

X₄是L或I，

X₇是D，K或T，

X₈是L或V，

X₁₁是V，I或L，

X₁₂是F或Y，

X₁₃是G，

X₁₄是K或E，和

X₁₅是L或Q；

其中所述聚合酶相对于X₁₃为D或E而其它方面相同的DNA聚合酶具有改良的核酸延伸速率。

2.权利要求1的DNA聚合酶，其中

X₂选自P，A，E，T，和V；

X₅选自N，R，G，和S；

X₆选自R，P，S，和T；

X₉选自E，G，Q，S，和A；和

X₁₀选自R，T，A，V，Y，S，和N。

3.权利要求1的DNA聚合酶，其中所述聚合酶包括嵌合聚合酶。

4.权利要求3的DNA聚合酶，其中所述嵌合聚合酶与CS5 DNA聚合酶(SEQ ID NO：20)或CS6DNA聚合酶(SEQ ID NO：21)具有至少90％的序列同一性。

5.权利要求3的DNA聚合酶，其中所述嵌合聚合酶

包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21，或相对于SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21包含一个或更多个选自G46E、L329A、和E678G的氨基酸取代；并且

相对于SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21包括E558G改变。

6.权利要求1的DNA聚合酶，其进一步包含热可逆共价修饰。

7.重组核酸，其编码根据权利要求1的DNA聚合酶。

8.表达载体，其包含权利要求7的重组核酸。

9.宿主细胞，其包含权利要求8的表达载体。

10.生产DNA聚合酶的方法，所述方法包括：

在适合编码突变型DNA聚合酶的核酸表达的条件下，培养权利要求9的宿主细胞。

11.实施引物延伸的方法，其包括：

在适合引物延伸的条件下，使权利要求1的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板和游离核苷酸相接触，从而产生延伸的引物。

12.权利要求11的方法，其中所述多核苷酸模板是RNA或DNA。

13.根据权利要求11的方法，其中所述游离核苷酸包括非常规核苷酸，所述非常规核苷酸包括核糖核苷酸或标记的核苷酸。

14.权利要求11的方法，其包括在适合多核苷酸扩增的条件下，使DNA聚合酶与引物对、多核苷酸模板和游离核苷酸相接触。

15.生产延伸的引物的试剂盒，包括：

至少一个提供根据权利要求1的DNA聚合酶的容器，

选自下列的一个或更多个另外的容器：

(a)提供在引物延伸条件下能够与预定的多核苷酸模板杂交的引物的容器；

(b)提供游离核苷酸的容器；和

(c)提供适合引物延伸的缓冲剂的容器。