[发明专利]新型DNA片段与含有该片段的重组载体、利用它们转化得到的转化体以及它们的应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于生产重组蛋白质的、具有调节转录的碱基序列与编码信号肽的碱基序列的DNA片段和含有该片段的重组载体、利用它们转化得到的转化体以及它们的应用。需要说明的是，作为相关申请的相互参考，本申请要求2007年7月13日提出的日本专利申请2007-183934号的优先权，其全部记载作为公开特别援引于此。 

背景技术

随着近年来遗传工程学的进步，能利用各种生物体作为宿主细胞生产蛋白质。特别是熟知将含有外来基因的重组载体导入宿主细胞的宿主-载体系统。如果使用宿主-载体系统，则可以在不将外来基因插入宿主细胞的染色体的情况下获得重组蛋白质。 

作为宿主-载体系统中的宿主细胞而广泛使用的是大肠杆菌(Escherichia coli)(例如参见日本专利2988951号公报以及作为其同族专利的欧州0441361号公报与美国5304471号公报(以下，有时将它们称为专利文献1)，上述专利的全部记载作为公开特别援引于此)。大肠杆菌中，传代时间短至约为20分钟，可以将各种糖类同化并增殖。并且，正在开发适合大肠杆菌的大量质粒载体，以大肠杆菌为宿主细胞的宿主-载体系统实现重组蛋白质的迅速且稳定的工业生产。 

但是，由于大肠杆菌的在菌体内蓄积重组蛋白质的性质，存在下述对于大量且稳定生产重组蛋白质不利的方面：抑制大肠杆菌本身的生育，并且在菌体内的蛋白质分解酶(蛋白酶)的作用下，重组蛋白质的功能容易丧失。并且，为了获得重组蛋白质而必须将菌体回 收，破碎，并且非常小心翼翼地除去作为发热性物质之一的脂多糖。因此，也产生了导致用于收集·纯化重组蛋白质的工序变复杂的问题。 

为此，为了解决上述问题，目前为止正研究利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的宿主-载体系统。枯草芽孢杆菌的传代时间约为30分钟，与大肠杆菌基本相同，能将蛋白质分泌到菌体外，并且不含有脂多糖作为菌体构成成分。因此，若与使用大肠杆菌的宿主-载体系统相比较，使用枯草芽孢杆菌的宿主-载体系统具有可以大量且稳定地生产重组蛋白质，并且可以容易地收集·纯化重组蛋白质的优点。 

例如，作为利用以上述枯草芽孢杆菌为宿主的宿主-载体系统生产重组蛋白质的例子，报导了将来自化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)株的链丝菌素O基因导入表达载体，利用所得的重组载体转化枯草芽孢杆菌，由此可以由培养上清液得到链丝菌素O(参见日本特开平05-184372号公报(以下，有时也称为专利文献2)，其全部记载作为公开特别援引于此)。 

发明内容

发明所需解决的课题

但是，根据本发明人的研究，在使用枯草芽孢杆菌的宿主-载体系统中，根据重组蛋白质的种类，有时重组载体上的调节转录的碱基序列(以下称为“基因调节区域”)基于某种原因而不能正常发挥功能。为此，明确了存在抑制重组蛋白质表达的问题。另外，还明确了即使基因调节区域正常发挥功能，在编码信号肽的碱基序列(以下称为“信号肽基因”)不发挥功能，或者基因调节区域与信号肽基因的组合不适当的情况下，也存在重组蛋白质以容易受到蛋白酶等的分解的状态残留在细胞内或细胞膜内等问题。 

为此，明白了解决上述问题的宿主-载体系统的确立对于以枯草 芽孢杆菌为宿主生产重组蛋白质是必须的，所述宿主-载体系统可以与重组蛋白质种类无关地大量表达重组蛋白质基因并有效分泌到细胞外。 

因此，本发明的第一目的在于提供在以枯草芽孢杆菌为宿主的系统中，可以与重组蛋白质的种类无关地大量且有效生产蛋白质的新方法。更具体而言，在于提供可以与重组蛋白质的种类无关地大量表达重组蛋白质的含有基因调节区域的DNA片段。此外，还在于提供可以有效地将重组蛋白质分泌到细胞外的含有基因调节区域与信号肽基因的组合的DNA片段。并且，还在于提供使编码重组蛋白质的碱基序列(以下，称为“重组蛋白质基因”)连接于基因调节区域或基因调节区域与信号肽基因的下游而得到的DNA片段。 

本发明的第二目的在于提供含有上述DNA片段的重组载体、利用它们转化的转化体以及利用它们的重组蛋白质的制备方法。 

用于解决课题的手段