[发明专利]树突状细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种树突状细胞的制备方法，并提供制备的树突状细胞及其利用方法。 

背景技术

树突状细胞(dendritic cell；DC)是存在于外周血、皮肤、淋巴器官及胸腺中的抗原递呈细胞(APC)之一，富集于淋巴组织及非淋巴组织中(参照Steinman，R.M.1991，Ann.Rev.Immunol.9：271；Banchereau，J.B.及R.M.Steinman，1998，Nature 392：245)。树突状细胞具有强大的抗原递呈能力，可将抗原肽表达到树突状细胞的MHC I类和MHC II类上，并分别激活CD4、CD8 T细胞，由此诱导活体内对特定抗原(病原微生物抗原、肿瘤抗原、移植抗原等)的免疫应答。 

DC的强大免疫诱导功能非常适用于多种肿瘤的免疫疗法(DC治疗)。本发明者们的以往报告表明，在小鼠试验中，用仙台病毒(SeV)刺激的DC具有较强的抗肿瘤效果(S.Shibata et al.，J.Immunol，2006 177：3564-3576；Yoneyama，Y.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2007，355：129-135)。而抗肿瘤疗效颇受DC接种量的影响。临床试验也认为接种的DC量很大程度影响到治疗效果，但出于患者状态的原因，可提取的DC前体细胞(DCprogenitors)数量大多极为有限，不能获取足够数量的DC，因而无法达到理想的治疗效果。所以，如何高效率地扩增有限的DC前体细胞，是解决问题的关键。 

非专利文献1 Steinman，R.M.，1991，Ann.Rev.Immunol.9：271-296 

非专利文献2 Banchereau，J.B.和R.M.Steinman，1998，Nature 392：245-252 

非专利文献3 Shibata，S.et al.，J.Immunol，2006177：3564-3576 

非专利文献4 Yoneyama，Y.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2007，355：129-135 

发明的内容 

发明要解决的问题 

鉴于以上情况，本发明所要解决的问题是提供一种可有效制备大量树突状细胞的方法。 

解决问题的方法 

为开发能够有效扩增DC前体细胞并使其分化成DC的方法，本发明者们通过添加各种细胞因子，将DC前体细胞按不同时间培养，分化成DC后，以DC表面标记为指标，分析了扩增的细胞。结果发现，在含有干细胞因子(Stem cell factor；SCF)和白细胞介素(IL)-3的培养基中培养的DC前体细胞明显增殖。而在上述SCF和IL-3以外再加入Flt-3配体和IL-6(即含有Flt-3配体、SCF、IL-3、IL-6(简称FS36))的培养基中培养的DC前体细胞的扩增更加明显。与抽取后直接分化相比，通过GM-CSF和IL-4、以及GM-CSF和SCF分化扩增细胞所得的DC量高达几百倍。尤其在FS36中培养约3周后分化的细胞集团，其DC比例明显提高，由此表明FS36培养3周左右是极为优良的DC扩增方法。与以往分化方法所得DC同样，扩增后所得细胞可通过RNA病毒的感染和LPS等，提高co-stimuratory molecules的CD80和CD86的表达水平。另外，在含有GM-CSF和SCF的培养基中培养人CD34⁺细胞也可以显著扩增DC。与上述方法相同，所得DC可通过LPS提高CD86的表达水平。所以，本发明提供一种可大量扩增DC前体细胞的方法，以及将所得DC前体细胞高效率分化为DC的方法。通过这些方法制备的DC可用于癌症及感染性疾病的免疫疗法。 

即，本发明涉及一种树突状细胞的制备方法、所制备的树突状细胞以及该细胞的利用方法，具体涉及 

〔1〕一种制备树突状细胞的方法，其包含在多种细胞因子存在下培养树突状细胞前体细胞的步骤。 

〔2〕〔1〕所述的方法，其中所述的多种细胞因子是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及干细胞因子(SCF)。 

〔3〕〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述的树突状细胞前体细胞是来自人的细胞。 

〔4〕〔2〕或〔3〕所述的方法，其中，所述的步骤是在1ng/ml以上的GM-CSF、和0.5ng/ml以上的SCF的存在下，培养树突状细胞前体细胞的步骤。