[发明专利]分枝杆菌的电穿孔和抗原在分枝杆菌中的过量表达

说明书

技术领域

本发明提供了具有改进疫苗特性的分枝杆菌菌株，可以用作对抗肺结核的预防接种试剂。这些分枝杆菌菌株优选选自被鉴定为具有有效免疫原性的亲本株，不表现抗生素拮抗性，并且不显示向革兰氏阴性菌的水平转移。本发明也提供了具有改进特性的分枝杆菌，可以传递具有疫苗特性的转基因，用于对抗其他疾病的预防接种和癌症的治疗。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)已经感染了世界上三分之一的人群，每年引起8百万人得病并杀死1.6-2.2百万人，这些人大多数生活在发展中世界。结核病(TB)是一个全球比例的流行病，因为结核病与艾滋病病毒的交叉传播，它正在增加并且变得甚至更加致命。结核病是患有艾滋病的人群的头号杀手。

卡介苗(BCG)是当前被广泛使用的结核病疫苗，在80多年前被研制出来，并且在其被测试时，它对抗肺结核的疗效有很大的变化率，包括最近在印度所作的一次大范围的试验中没有有效性。(Fine et al.，Vaccine，16(20)：1923-1928；1998；Anonymous，IndianJ Med Res.，Aug；110：56-69；1999)。尽管如此，世界卫生组织目前仍然对结核病高发国家的所有孩子(除了有艾滋病症状的那些孩子)在出生时或与检疫部门第一次接触时就推荐卡介苗。这个政策是基于卡介苗能防止严重的儿童时期的结核病。(Lanckriet等人.，IntJ Epidemiol，24(5)：1042-1049；1995；Rodrigues等人，J Epidemiol Community Health，45(1)：78-80；1991)。卡介苗对与超过幼儿时期的结核病的预防是一个引起争议的话题，其有限的数据造成了混乱的结果。发展中国家的儿童与成年的结核病的高发生率，虽然在这些国家婴儿的卡介苗的免疫接种是广泛实行的，然而，这显示了当前给药的卡介苗经过这么多年，当人们处于结核病的危险之中时，并不是高度有效的，因此，卡介苗被不认为是一个干预并控制结核病的合适的公共卫生工具。

大约有70％接触结核病生物体的人，这些人有正常的免疫系统，不会被传染，在被传染的人中，大约只有5％在最初的两年发展成疾病。大多数被感染的个体都会抑制住感染，这是与对结核分枝杆菌抗原的有力的细胞免疫应答的发展相关的。当免疫力下降时，另外的5％稍后重新激活。初次的和重新激活的这两种疾病在带有艾滋病毒的人群中非常常见，再一次强调了免疫性在防止和控制感染上的的重要性。

发明内容

因为大多数人都能控制结核病，所以这里有很好的理由希望，通过诱导出合适种类的长效的免疫性，从而有可能开发出有效的疫苗来防止接触后初期的感染，防止早期的疾病的发展，防止从潜伏状态重新激活，防止治疗后的旧病复发。终极目标是，它是系统疫苗的使用和化学治疗的干预的组合来最终消除结核分枝杆菌成为人的病原体。

考虑到儿童时期的卡介苗接种被认为在预防急性结核病时起着关键的作用，在没有压倒优势的证据证明新的结核病的疫苗是更好的产品时，那就很难在试验中替换卡介苗来评价候选的结核病疫苗。问题是结核分枝杆菌主要是人特异性的病原体，动物模型只能模仿寄主-病原体相互作用的一部分。因此，证明新的结核病疫苗拥有改进的效力的明确证据只能从人类的对照现场试验中获得。这些考虑导致了许多研究者得出结论，得到改进的结核病疫苗的的一个关键步骤将是开发改进的卡介苗菌株，尽管动物模型有它们的局限性，但它们仍然暗示了能过量表达保护性抗原的重组卡介苗(rBCG)与卡介苗相比，其效力有所提高。

某些结核分枝杆菌抗原具有疫苗的特性，并且当作为疫苗制剂给药于动物时，这些抗原给予的保护与卡介苗单独给药时获得的保护是类似的(Anderson，Infect Immun，62(6)2536-2544；1994)。为了推动这些候选疫苗向前发展，已开发出一个策略来提高卡介苗中这些抗原的免疫原性。因此，卡介苗菌株被研制成能过量表达选定的结核分枝杆菌抗原，而且这些衍生于亲本卡介苗菌株的重组卡介苗(rBCG)菌株与亲本卡介苗菌株相比，显示出能诱导更加强大的保护作用(Horwitz et al.，Infect Immun，72(4)：1672-1679；2003)。在一项研究中，表达抗原85B(在此被称为“Ag 85B”)的重组卡介苗菌株与混合相同抗原的卡介苗相比，被证明是更具有效性(Horwitz et al.，supra，2003)。根据这些发现，该方法有着巨大的潜力。