[发明专利]使用重组微生物制备(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用重组微生物制备光学活性(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟 丁酸酯的方法。更具体地说，本发明涉及：一种用于制备(S)-3-羟丁酸的重 组微生物，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基 因和编码酰基辅酶A水解酶的基因转化该微生物；一种使用所述重组微生 物制备(S)-3-羟丁酸的方法；一种用于制备(S)-3-羟丁酸酯的重组微生物，用 编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码酰基 辅酶A水解酶的基因和编码脂肪酶的基因转化该微生物；以及一种使用所 述重组微生物制备(S)-3-羟丁酸酯的方法。

背景技术

(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯是十分有效的手性中间体，并具有广泛的 应用，如在塑料、芳烃、医药和农药领域中(Speciality Chemicals Magazine， April：39，2004)。例如，它们可以用来合成(S)-1，3-丁二醇、用于通过还原乙 基-(S)-3-羟丁酸酯制备多种抗生素和信息素的中间体(T.Ferreira等， Tetrahedron，46：6311，1990)，并且还可用作除草剂(S)-食菌甲诱醇 ((S)-sulcatol)的前体(K.Mori等，Tetrahedron，37：1341，1981)、b-内酰胺类 抗生素碳青霉烯(Carbapeneme)的前体(T.Chiba等，Chemistry letters， 16：2187，1987)，以及维生素样营养物L-肉毒碱的前体(B.N.Zhou等，Journal of American Chemical Society，105：5925，1983)。

有制备酯的传统方法，如用催化剂二膦化钌对前手性前体3-酮酸酯的 非对称还原氢化作用(R.Noyori等，Journal of the American Chemical Society， 109：5856，1987)，但这种方法需要非常昂贵的金属催化剂、纯底物和非常高 的压力反应器。此外，使用酵母作为全细胞催化剂通过生物催化还原b-酮 酸酯生产的(S)-3-羟丁酸乙酯(产率58％且光学纯度为94％ee)由于在微生物 中存在的各种氧化还原酶而表现出低光学活性(Tetrahedron Letters，34：3949， 1993)。

据报道，光学活性(R)-3-羟基烷酸酯是通过操纵微生物的代谢途径由葡 萄糖生物合成的(Lee等，Biotechnol Bioeng，65：363，1999；Lee和Lee.，Appl Envron Microbiol，69：1295，2003；Gao等，FEMS Microbiol Lett，213：59， 2002)。有两条路线生产(R)-3-羟基烷酸酯：一是可生物降解的聚合物(多羟 基烷酸酯)的自溶(Lee等，Biotechnol Bioeng，65：363，1999；Lee和Lee.，Appl Environ Microbial，69：1295，2003)；另一种是从由葡萄糖合成的(R)-3-羟基烷 酰辅酶A中移除辅酶A，而不是可生物降解聚合物的自溶，以制备(R)-3- 羟基烷酸酯(Gao等，FEMS Microbiol Lett，213：59，2002)。在第二路线中， (R)-3-羟丁酰辅酶A是使用β-酮硫解酶(PhaA)和(R)-3-羟丁酰辅酶A还原酶 (PhaB)由葡萄糖制备，然后使用磷酸转丁酰酶(ptb)和丁酸激酶(BuK)从(R)-3- 羟丁酰辅酶A中移除辅酶A(Gao等，FEMS Microbiol Lett，213：59，2002)。

虽然已报道了用于制备光学活性(S)-3-羟丁酸酯的化学和生物催化路 线，但是通过操纵微生物的代谢途径由葡萄糖生物合成制备光学活性(S)-3- 羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯的路线还未见报道。

因此，本发明者试图生物合成光学活性(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯， 并最终发现，通过简单的过程由在微生物的糖酵解中产生的乙酰辅酶A生 物合成具有高光学纯度的(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯，该过程包括通过引 入到微生物中的重组基因操纵代谢途径而不用使用昂贵的金属催化剂或底 物。他们的这一发现导致本发明。

发明内容

【技术问题】

本发明旨在提供用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物和包括培养所述重 组微生物的制备(S)-3-羟丁酸的方法。