[发明专利]增强来自I-CreI的大范围核酸酶的切割活性的方法

权利要求书

1.用于增强来自I-CreI的大范围核酸酶的切割活性的方法，其特征是包括对I-CreI中选自以下的至少一个氨基酸残基进行位点特异性突变：19位甘氨酸(G19)、54位苯丙氨酸(F54)、87位苯丙氨酸(F87)、79位丝氨酸(S79)、105位缬氨酸(V105)和132位异亮氨酸(I132)。

2.权利要求1的方法，其中19位甘氨酸被改变为丝氨酸(G19S)或丙氨酸(G19A)，54位苯丙氨酸被改变为亮氨酸(F54L)，87位苯丙氨酸被改变为亮氨酸(F87L)，79位丝氨酸被改变为甘氨酸(S79G)，105位缬氨酸被改变为丙氨酸(V105A)，和/或132位异亮氨酸被改变为缬氨酸(I132V)。

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中在所述来自I-CreI的大范围核酸酶的同一单体中突变选自G19、F54、F87、S79、V105和I132的至少两个氨基酸残基。

4.权利要求3的方法，其中在所述来自I-CreI的大范围核酸酶的同一单体中突变V105和I132残基。

5.权利要求1到4中任一项的方法，其中对所述来自I-CreI的大范围核酸酶的两个单体均进行突变。

6.权利要求5的方法，其中一单体具有G19S或F87L突变，另一单体同时具有V105A和I132V突变。

7.权利要求1到6中任一项的方法，其中所述来自I-CreI的大范围核酸酶是异二聚体。

8.权利要求7的方法，其中所述来自I-CreI的异二聚体大范围核酸酶由两个单体组成，每个单体包含在I-CreI的26到40位和/或44到77位上的不同突变，所述大范围核酸酶能够切割非回文的目的基因组DNA靶序列。

9.权利要求1到8中任一项的方法，其中所述来自I-CreI的大范围核酸酶在I-CreI的137到143位上包含一个或多个替换，所述替换改变了针对I-CreI位点中±1到2、±6到7和/或±11到12位核苷酸的特异性。

10.权利要求7到9中任一项的方法，其中所述来自I-CreI的异二聚体大范围核酸酶的两个单体之一包含G19S突变，所述突变破坏功能性同二聚体的形成。

11.权利要求10的方法，其中另一单体包含不同的突变，所述突变破坏功能性同二聚体的形成或有助于异二聚体的形成。

12.权利要求7到11中任一项的方法，其中所述来自I-CreI的异二聚体大范围核酸酶是专性异二聚体，其中一个单体包含D137R突变，另一单体包含R51D突变。

13.权利要求7到11中任一项的方法，其中所述来自I-CreI的异二聚体大范围核酸酶是专性异二聚体，其中一个单体包含K7E突变，另一单体包含E8K突变。