[发明专利]包含犬细小病毒遗传性变体的疫苗

说明书

序列表

本申请包括2008年6月12日创建的伴随文本文件“Sequence.txt”的完整内容作为序列表，所述文本文件包含3,780字节，在此通过引用并入本文。

说明书

发明背景

发明领域

总的来说，本发明涉及改善的犬细小病毒(CPV)疫苗制剂和诊断测试。特别地，本发明提供了改善的CPV疫苗制剂和诊断测试，其包括在犬群体中目前循环的新出现的占优势CPV变体。

发明背景

犬细小病毒(CPV)主要是感染犬特别是幼年犬的肠病原体。细小病毒感染的特征在于超过4-5周龄的犬和幼犬中的急性腹泻、发热和白细胞减少症，以及更年幼的幼犬中的心肌病。来自未接种犬的疾病死亡率极高。尽管针对CPV的疫苗是可获得的，但CPV是单链RNA病毒且具有极度的突变能力，所以病毒显示在抗原上改变的显著能力，并且从而逃避由疫苗提供的免疫保护。因此，抗原型和致病剂的基因型的持续监控是必要的。

CPV首先在1978年分离，并且命名为“CPV-2”，以使其与细小病毒-犬细小病毒(CMV或CPV-I)区分。CPV-2一般被认为是猫传染性粒细胞缺乏症病毒(FPV)或貂肠病毒(MEV)的遗传性变体，并且在遗传和抗原上与感染貂、狐狸、浣熊和其他肉食动物的细小病毒非常紧密相关。CPV衣壳包含仅具有两个可读框的约5200个碱基的单链DNA基因组，但由于可变mRNA剪接而编码至少4种蛋白质。细小病毒衣壳由两种病毒蛋白质(VP)——VP1和VP2组成，其中VP2是主要免疫原性细小病毒衣壳蛋白质。原始CPV分离物的遗传性变体在1979-1980年鉴定，并且命名为CPV 2a型。在二十世纪八十年代中期，鉴定了另一种变体，2b型，并且自那以后，2a和2b型看起来已完全取代原始CPV-2。目前疫苗仅针对2a和2b变体，尽管2a变体在美国已不再检测出。对于CPV发现和进化的综述，参见Parrish和Kawaoka，2005。

CPV-2b仅在两个氨基酸位置处不同于CPV-2a：2a中的Asn-426(由AAT编码)是2b中的Asp(由GAT编码)，并且2a中的Ile-555是2b中的Val。Ile-555至Val的改变实际上是至原始2型序列的逆转。CPV-2a和2b抗原型看起来在多年中是相对稳定的。然而，在2000年，描述了变体“2c”，其中位置426是由GAA编码的Glu(位置555仍是Val)。2c变体已在意大利(Buonavoglia等人，2001)、越南(Nakamura等人，2001)和其他国家包括西班牙(Nakamura等人，2004；Decaro等人，2006)得到报告，但到目前为止不存在2c变体在美国证实的报告，并且CPV疫苗仍未更新以包括此种变体。这是特别重要的，因为与主要感染幼犬的先前描述的变体不同，CPV2c具有感染成年犬的能力。此外，在位置494和572处具有密码子变异的2b变体序列在2003年提交给GenBank(gi：54646340)，并且由Shackelton等人在2005年报告(Proceedings National Academy Sciences 102：379-384)，但未基于此种序列提出在CPV疫苗或诊断组合物中的改变。

当疫苗未更新时，出现几个问题。首先，即使接种过的犬也可能对疫苗中未包括的CPV变体引起的感染易感。其次，当接种过的犬生病时，它们的主人经常声称疫苗中的病毒株引起疾病。这通常导致对物主支付赔偿，因为疫苗公司没有切实的途径来提供相反的证据。

已提出几种CPV疫苗制剂：

Appel等人的美国专利4,193,990和4,193,991分别描述了异型和灭活(“杀死的”)病毒疫苗，其中示例性疫苗提供抗原始CPV的保护。

Carmichael等人的美国专利4,303,645描述了包含由非肿瘤形成细胞系中病毒延长的连续传代产生的减毒CPV的疫苗。示例性疫苗还提供抗原始CPV分离物的保护。

Wood等人的美国专利4,971,793和Valdes等人的美国专利5,882,652都描述了重组亚单位疫苗，其包括在重组杆状病毒中产生的CPV VP-2蛋白质。VP-2蛋白质无特定类型或亚型。

Parrish等人的美国专利5,885,585描述了包含减毒形式的2b变体的CPV疫苗。

由于CPV病毒突变且发展新抗原性变体的能力，存在监控CPV变体的基因构成且开发反映目前CPV变体的疫苗和诊断测试的迫切需要。

发明概述