[发明专利]修饰植物中的糖蛋白产生

说明书

技术领域

本发明涉及修饰植物中糖蛋白产生的方法。本发明还提供了具有经修饰的糖蛋白产生的植物。

发明背景

免疫球蛋白(IgG)是对多种性质的特异性抗原对应物具有特征性亲和力的复合异多亚基蛋白。目前，对IgG生产细胞系的常规分离和IgG定向进化与分子工程技术的出现极大地影响了它们作为生物治疗剂和在一般生命科学市场中的发展。治疗性单克隆IgG(单克隆抗体，mAb)主宰着目前的新抗炎药和抗癌药市场，并且目前有数百种新的候选者处于针对改进应用或新应用的研究和临床开发中。每年的mAb市场需求从数克(诊断学)、数千克(抗毒素)到多达一百或数百千克(生物防御、抗癌、抗感染、抗炎药)。

尽管CHO细胞培养物仍然是它们优选的商业规模生产宿主，但目前公认的是，为了让mAb在生命科学市场中完全发挥作用，必须开发替代性的生产系统，因为这些培养物需要的设备不容易大规模调控，它们的建造和维护成本极高并且逐渐提高，而且其GMP认证在建设后仍然平均需要三年。即便是雇早期开发阶段，对具有可接受的产率和生产力的CHO细胞系的选择仍然是一个昂贵和长期的过程。会降低上游成本(更高的产率、更简单的技术和基础设施)，具有更短的前导时间、在容量方面更加灵活而同时满足现有细胞培养系统目前的生产力、品质和安全特性的新生产系统很可能在每个开发阶段对用于生命科学市场之mAb和疫苗的开发具有重大影响。

对mAb和目前应用于生命科学中的若干其他蛋白质的生产而言，植物是合适的宿主(近期综述见Ko和Koprowski 2005；Ma等，2005；Yusibov等，2006)。MAb已在稳定的转基因植物株系中以多达200mg/kg鲜重(FW)的产量生产，并且通过瞬时表达以多达20mg/kg FW的产量生产(Kathuria，2002)。Giritch等(2006)报道了对IgG而言200-300mg/kg叶重量的表达水平，其中一个列举的最大值为500mg/kg，其通过使用基于多病毒的瞬时表达系统获得。

植物和哺乳动物N-糖基化过程有差异。哺乳动物中N-糖基化的较后步骤为向复合聚糖上添加β1，4半乳糖、α1，6岩藻糖(β-1，4半乳糖、α-1，6岩藻糖)和末端唾液酸残基。然而在植物中添加的是β1，3半乳糖、α1，3岩藻糖(β-1，3半乳糖、α-1，3岩藻糖)，α1，4岩藻糖和β1，2木糖(α-1，4岩藻糖和β-1，2木糖)残基。α1，3-岩藻糖和β1，2木糖是一些植物变应原的糖表位组分，这些残基被认为可能是免疫原性的，并且不期望它们出现在治疗性蛋白质(包括抗体)上。

对肽的C端添加KDEL序列通常被用于确保肽从高尔基体上回收至ER。该方法被用于使用烟草叶的农杆菌渗入法生产非岩藻糖基化和非木糖基化的抗体(Sriraman等，2004)。然而，所添加的KDEL肽可能是免疫原性的，并且该方法对于生产治疗性蛋白质的适用性有限。

还通过修饰岩藻糖基转移酶和木糖基转移酶的表达，实现了对α1，3岩藻糖(α-1，3岩藻糖)和β1，2木糖(β-1，2木糖)添加的控制。在苔藓(Physcomitrella patens；Koprivova等，2004)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Strasser等，2004)中产生了不能在复合聚糖上添加α1，3岩藻糖和β1，2木糖的突变体。还通过在浮萍(Lemna minor)中表达靶向α1，3岩藻糖基转移酶和β1，2木糖木糖基转移酶基因的干扰RNA(RNAi)，实现了对植物岩藻糖基转移酶和木糖基转移酶表达的部分抑制(Cox等，2004)。然而，这些酶活性的完全抑制对若干植物物种具有有害影响，因为它们干扰关键的发育事件，例如花粉形成或结籽。RNAi诱导的mRNA特异性降解可能不是随时间稳定的，并且可能不适合用于生产治疗性药物的多种基于植物的平台，因为其被报道为对环境因素敏感。

WO 03/078637公开了人半乳糖基转移酶催化植物聚糖上添加末端β1，4半乳糖(GalT)的用途。通过使用与木糖基转移酶跨膜结构域的融合物得到的GalT表达并将其活性靶向顺面高尔基体导致末端半乳糖的添加和带有植物特异性残基的N-聚糖的减少(还见Bakker等，2006)。将这些植物与含有重组IgG的植物育种，导致含有岩藻糖和木糖的聚糖的显著但不定量的减少。