[发明专利]对样本成像的方法

说明书

技术领域

本发明的一个方面涉及图像处理方法，更确切地说，涉及对样本成像的方法。本发明的另一个方面涉及将所述方法应用到多光斑(spot)扫描显微镜。本发明的另外的方面涉及用于实施所述对样本成像的方法的计算机程序产品。

背景技术

光学显微术的各种技术在本领域中是已知的。

首先，一些显微镜使用无像差、具有大的视场并且具有重要的数值孔径的物镜。然而，这样的显微镜是昂贵的。

其次，扫描显微镜通过扫描物镜关于待测量的样本的焦点或者相反的情况来形成图像。这样的扫描显微镜使用具有小的视场的物镜并且因而与前面提到的显微镜相比不那么昂贵。然而，与具有大的视场的显微镜相比，这样的显微镜花费长时间或者需要复杂的方法以便快速地扫描样本。

第三，多光斑显微镜通过利用大量光斑(更确切地说，光斑阵列)扫描样本来形成图像。这样的多光斑显微镜相对于扫描显微镜在短时间内产生具有大的视场的图像，同时相对不那么昂贵。

像未染色样本或者生物样本(例如单细胞有机体、组织培养等等)那样的样本的成像由于这类样本通常具有低的本征对比度这一事实而变得困难。低对比度意味着跨样本限定的平面的吸收和折射率方面的变化非常小，典型地折射率变化的数量级为10^-2。结果，这类样本的某些特征在图像上保持不可见。

微分干涉对比度(DIC)显微术在本领域中是已知的并且允许增大这类样本的对比度。DIC显微术基于干涉原理。在DIC显微镜中，偏振光源被分离出两个光束，其采取通过样本的不同路径，因而具有不同的光路长度/相位，并且进一步被重新组合，从而导致干涉。因此，在利用DIC显微镜获得的图像中，样本的光学密度的变化导致可见的暗度变化(物理浮雕的外观)，就像在强烈的倾斜照明下观看的在相应面上具有强光和暗影的3D物体。然而，DIC显微镜具有复杂的光学结构，包含特别是偏振滤波器和诺马斯基(Nomarsky)改进的渥拉斯顿棱镜。

发明内容

本发明的目的是提出一种克服现有技术的至少一个缺陷的对样本成像的方法。特别地，本发明旨在增强利用多光斑扫描显微镜成像的、包括低本征对比度特征的样本的图像对比度。

依照第一方面，本发明涉及一种对样本成像的方法。该方法包括步骤：

-提供参考光斑阵列，

-利用参考光斑阵列照射样本并且获取至少一幅样本图像，所述样本图像包括从与样本相互作用的参考光斑阵列得到的样本相关光斑阵列，

-确定多个样本相关光斑中的每一个的光斑表征参数，以及

-通过在对应的样本相关光斑位置处绘制所述多个样本相关光斑中的每一个的光斑表征参数来构造样本的图像。

所述方法可以包括步骤：

-扫描样本和参考光斑阵列的相对位置，

-重复所述样本照射步骤、样本图像获取步骤和光斑表征参数确定步骤，以及

-通过绘制所述多个样本相关光斑中的每一个的光斑表征参数与样本相关光斑阵列和参考光斑阵列的相对位置的函数关系来构造样本的图像。

所述光斑表征参数确定步骤可以包括通过以下步骤来在参考光斑阵列与成像的样本相关光斑阵列之间进行比较：

-识别参考光斑阵列中的参考光斑，

-识别成像的样本相关光斑阵列中的样本光斑，以及

-将多个识别的样本光斑与相应的识别的参考光斑关联。

依照第一实施例，光斑表征参数的确定包括步骤：

-在成像的光斑阵列内确定所述多个识别的光斑的参考位置，

-在成像的样本相关光斑阵列内确定所述多个识别的光斑的样本位置，

-通过计算所述多个关联的光斑的参考位置与样本位置之差来确定多个光斑的位移矢量。

光斑表征参数的确定还可以包括步骤：计算位移矢量的幅度或相位或者关于笛卡尔坐标系的分量。

所述在成像的光斑阵列内确定所述多个识别的光斑的参考位置可以包括：

-定义至少两个参考位置，

-针对所述至少两个参考位置在成像的样本相关光斑阵列(IM_si)内确定识别的光斑的位移矢量，

-计算所述位移矢量的幅度平方的平均值，以及

-选择具有位移矢量幅度平方的最小平均值的参考位置。

依照第二实施例，所述多个光斑的光斑表征参数的确定包括：确定由于参考光斑阵列与样本相互作用而引起的光斑形状的改变。

依照第三实施例，所述多个光斑的光斑表征参数的确定包括：确定由于参考光斑阵列与样本相互作用而引起的偏振的改变。

依照第四实施例，所述方法还包括：