[发明专利]琥珀酸的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及使用微生物来制备琥珀酸的方法。

背景技术

使用棒状细菌的基因重组菌来制备琥珀酸等有用物质的方法已经为人们所知(参照专利文献1或2)。在培养棒状细菌来制备琥珀酸时，经常使用下述方法：首先，使细菌在好氧的条件下增殖从而获得菌体，并将其作为静止菌体使用而与有机原料进行反应。在这种情况下，一般来说，细菌的增殖在25～35℃的范围内进行，与有机原料的反应在30～37℃的范围内进行。

在专利文献3中，就棒状细菌的乳酸脱氢酶缺失菌株而言，分析了其增殖温度以及反应温度和琥珀酸生产性之间的关系，显示出在比生长最佳温度(增殖温度)高2～10℃的温度下进行琥珀酸生产反应时可以提高琥珀酸的生产性。在专利文献3的实施例2中示出了使用在30℃下增殖而得到的菌体在40℃下进行琥珀酸生产反应的实例，在这种情况下，将该实例与使用在30℃下增殖而得到的菌体并在37℃下进行琥珀酸生产反应的实施例1相比较，结果显示出其糖消耗的时间稍长。

另外，在专利文献2中公开了一种使用进行了修饰使得丙酮酸羧化酶活性得到增强的棒状细菌来制备琥珀酸的方法，但是没有对该细菌的反应温度和琥珀酸生产性间的详细情况进行研究。

专利文献1：日本特开平11-206385号公报

专利文献2：日本特开平11-196888号公报

专利文献3：日本特开2003-235593号公报

发明内容

本发明的课题在于，在使用微生物来制备琥珀酸的方法中，提高生产效率。

本发明人为解决上述课题进行了潜心的研究，结果发现，对于进行了修饰而使得丙酮酸羧化酶活性增强的棒状细菌而言，当反应温度在37～45℃的范围内时，琥珀酸的生产性变好，从而完成了本发明。

即，根据本发明可以提供下述的发明。

(1)一种琥珀酸的制备方法，该方法包括：菌体或其处理物，通过使菌体或其处理物在含有有机原料的反应液中与有机原料作用而生成琥珀酸，并收集该琥珀酸，所述菌体是对选自黄色短杆菌、乳酸发酵短杆菌和谷氨酸棒杆菌中的细菌进行培养而得到的，其中，所述细菌经过了修饰，使得与未修饰菌株相比，丙酮酸羧化酶活性增强，并且在37～45℃下使培养该细菌而得到的菌体或其处理物与有机原料作用。

(2)上述(1)所述的方法，其中，所述细菌经过了进一步的修饰，使得与未修饰菌株相比，乳酸脱氢酶活性降低。

(3)上述(1)或者(2)所述的方法，其中，在39～43℃下使培养上述细菌而得到的菌体或者其处理物与有机原料作用。

(4)上述(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，上述有机原料为葡萄糖或蔗糖。

(5)上述(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，上述反应液含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或者二氧化碳气体。

(6)上述(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，使有机原料在厌氧气氛下作用。

(7)一种含有琥珀酸的聚合物的制备方法，该方法包括：按照上述(1)～(6)中任一项所述的方法制备琥珀酸的步骤、以及将在上述步骤中得到的琥珀酸作为原料进行聚合反应的步骤。

附图说明

[图1]为表示质粒pMJPC17.2的构建顺序的图。带有下划线的数字表示由相应序列编号的序列构成的引物。

[图2]为表示MJ233/PC-4/ΔLDH菌株以及MJ233/ΔLDH菌株的反应温度与相对菌体比速度之间关系的图。

[图3]为表示MJ233/PC-4/ΔLDH菌株的反应温度与反应6小时后的琥珀酸积累浓度之间关系的图。

具体实施方式

下面，详细地对本发明的实施方式进行说明。

1.本发明中使用的微生物

本发明的方法中使用的微生物为选自黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的细菌，且所述细菌进行了修饰，使得与未修饰菌株相比，丙酮酸羧化酶活性增强。

需要说明的是，黄色短杆菌、乳酸发酵短杆菌和谷氨酸棒杆菌之间的亲缘关系非常近，性质也相类似，在现在的分类学中，有时也被划分成同一种类。

作为本发明中使用的微生物的亲本株的特别优选的具体实例，可以列ATCC13869等。