[发明专利]具有生产1，4-丁二醇能力的突变体和使用该突变体制备1，4-丁二醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够生产1，4-丁二醇的突变体微生物，以及使用该突变体微生物制备1，4-丁二醇的方法。

背景技术

可生物降解的聚合物已经被建议作为合成聚合物的替代品，合成聚合物是严重环境污染的重要原因之一。在目前正在开发的各种可生物降解的聚合物中，聚-β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate)是各种微生物在营养不平衡状态下储存的一种可生物降解的聚合物，其具有优良的特性，如生物可降解性、水抗性、压电性和生物相容性。尤其是4-羟基丁酸酯，其是聚羟基链烷酸酯(PHA)的一个例子，具有聚酯样特性，并显示从结晶塑料到高弹性橡胶的特性的许多特性。因此，目前正在对微生物可生物降解的塑料进行大量研究。

此外，4-羟基丁酸酯可以很容易被转变成具有4个碳原子的各种化学制品，如1，4-丁二醇、γ-丁内酯(GBL)和THF。尤其是，1，4-丁二醇是一种以如聚合物、溶剂和精细化学制品中间体多种形式存在的重要的工业化学制品。虽然具有4个碳原子的大多数化学制品目前是从1，4-丁二醇、马来酐等等合成的，但是由于油价格的增加而导致的增加的生产成本，需要开发用于补偿和替代常规的化学生产方法的另一种方法。生物学方法已经被建议作为这种替代方法。

同时，琥珀酸(succinate)，具有4个碳原子的二羧酸，是在厌氧条件下培养微生物时产生的一种有机酸。现在，多种微生物被用作生产琥珀酸的细胞，而且由于有效的发酵方法以及分离和纯化方法的发展，它的生产成本变得更低。还可以由琥珀酸生产4-羟基丁酸酯，而且具有4个碳原子的各种有机酸可以源自4-羟基丁酸酯。

PCT公开第WO 2005/052135号是公开了一种有效生产琥珀酸的方法的专利申请的一个例子，其中，腔细菌(Lumen bacterial)突变体在不产生其他有机酸的情况下生产高浓度的琥珀酸，和一种使用该突变体制备琥珀酸的方法。另外，韩国专利申请第10-2004-60149中公开了一种制备能够生产高浓度的琥珀酸的大肠杆菌突变体的方法，并且韩国专利申请第10-2005-0076301号、第10-2005-0076317号和第10-2005-0076348号中公开了一种使用新基因制备琥珀酸的方法。

如上面所解释的，迫切需要一种能够生产1，4-丁二醇的突变体和使用该突变体制备1，4-丁二醇的生物学方法，1，4-丁二醇是一种具有4个碳原子的工业上重要的化学制品。

发明内容

技术问题

本发明旨在提供一种能够高效生产1，4-丁二醇的突变体微生物，以及使用该突变体微生物制备1，4-丁二醇的方法。

技术方案

一个方面，提供了一种能够生产琥珀酸的微生物和使用该微生物制备1，4-丁二醇的方法，所述微生物优选为显示出高1，4-丁二醇产量的突变体，其中，引入或增强编码把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯的酶的基因和编码把4-羟基丁酸酯转变成1，4-丁二醇的酶的基因。

另一个方面，提供了SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的丁基-辅酶A脱氢酶基因和具有该基因的重组载体，该基因将4-羟基丁基-辅酶A有效生产为1，4-丁二醇。

在下文中，将更详细地描述本发明。

作为使用能够生产琥珀酸的微生物制备1，4-丁二醇的努力的结果，本发明人通过在能够生产琥珀酸的微生物中诱导或增强与4-羟基丁酸酯生物合成相关的基因和/或与1，4-丁二醇生物合成相关的基因，开发了一种生产1，4-丁二醇的突变体微生物，并发现，该突变体微生物有效生产1，4-丁二醇。该发现导致了本发明。

这里使用的术语“增强”指与原始表达水平相比基因表达水平的增加。如果在突变之前微生物中没有待增强的基因，那么可以向该微生物中引入至少一个基因，然后增强。并且，如果在突变之前在微生物中有待增强的基因，可以通过如上所述的相同的方法向该微生物中引入至少一个基因，或者可以通过遗传工程技术对原来存在于微生物中的基因进行操作以增加基因表达。例如，当增强表达的基因存在于待突变的微生物中时，可以用更强的启动子代替用于操纵基因表达的原始启动子，从而增强基因表达。

能够生产琥珀酸的微生物可显示出高琥珀酸产量，该微生物优选为选自细菌、酵母和真菌中的一种，更特别地为细菌，例如，腔细菌(Lumen bacteria)、棒状杆菌(Corynebacterium species)、短杆菌(Brevibacterium species)和大肠杆菌(E.coli)。