[发明专利]蛋白的热稳定化

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2007年7月10日提交的美国临时申请号60/948,976和2007年11月13日提交的美国临时申请号60/987,661的权益，这两份申请在此完整通过援引并入。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是在国立卫生研究院给予的资助号DA021416-01和国家科学基金会给予的资助号IIS-0324845的政府支持下完成的。政府对本发明享有一些权利。

技术领域

本申请一般地涉及抗可卡因治疗。

背景技术

可卡因的滥用是棘手的社会和医疗问题，其难于通过药物疗法进行补救。可卡因阻断单胺、多巴胺、去甲肾上腺素和血清素的重摄取，从而延长并增强这些神经递质在中枢神经系统中的作用(Benowitz，1993)。可卡因毒性表现为惊厥和心脏功能障碍(例如，心肌梗死，心脏心律不齐，血压增加，中风或壁间动脉瘤，和心肌需氧量增加)，这归因于对神经递质系统和心肌钠通道阻断的作用(Bauman andDiDomenico，2002；Wilson and Shelat，2003；Knuepfer，2003)。因为可卡因具有轻易穿越血脑屏障的能力并且其作用广泛分布于中枢和外周神经系统，过度剂量可能导致猝死(综述参见Bauman and DiDomenico，2002)。

尽管已经完全清楚可卡因的作用机制，但该信息还没有促成开发出可在滥用和过度剂量情况下使用的有效的可卡因拮抗剂。可卡因快速和多效作用为急性可卡因毒性的治疗提出了一个复杂的问题(Carroll and Kuhar，1999)。现有的治疗阿片样物质滥用的两类疗法，拮抗法(例如，纳曲酮)和替代法(例如，美沙酮)，与可卡因的情况不具有相似之处，尽管正在考虑对后者的尝试(例如，Grabowski et al，2004)。一种方法是通过施用内源性酯酶、可卡因特异抗体或催化抗体来阻止或减少可卡因到达作用位点。

天然存在的可卡因是通过血清丁酰胆碱酯酶(BChE)水解苯甲酰酯产生无毒的芽子碱甲酯和安息香酸。在肝脏中，羧酸酯酶hCE-2水解甲酯产生苯甲酰芽子碱和甲醇。血液中可卡因的清除半衰期范围为0.5到1.5小时(Inaba，1989)。曾经有数次尝试使用天然存在的BChE或遗传改造的BChE来增加可卡因降解(参见，例如，Carmona et al，2000；Xie et al，1999；Sun et al，2002a；Sun et al，2002b；Duysen et al，2002；Gao and Brimijoin S，2004；Gao et al，2005)。其他研究人员使用单克隆抗体Mab 15A10作为可卡因的催化抗体(参见例如，Landry et al，1993；Mets et al，1998)，而其他人探究了可卡因疫苗的使用(参见例如，Kosten et al，2002)。

古柯植物周围土壤中固有的一种细菌，红球菌属物种MB 1(Rhodococcus sp.MB 1)，已经进化出利用可卡因作为其唯一碳和氮源的能力。该细菌表达与BChE作用类似的可卡因酯酶(CocE)，其水解可卡因的苯甲酰酯，产生芽子碱甲酯和安息香酸(图1)(Bresler et al，2000；Turner et al，2002；Larsen et al，2002)。已经分离并克隆出CocE的基因(Bresler et al，2000)，CocE的晶体结构也已经被确定(Turner etal，2002；Larsen et al，2002)。

纯化的酶(MW～65kDa)非常高效的催化可卡因，其Michaelis-Menten动力学k_cal＝7.2s^-1和K_m＝640nM(Turner et al，2002；Larsen etal，2002)，几乎比内源性酯酶大三个数量级，很可能，足够快速的为服用可卡因过量的人解毒(Landry et al，1993；Mets et al，1998)。此外，酯酶还代谢乙基苯酰爱康因(cocaethylene)(可卡因和醇的潜在代谢产物)，几乎与其代谢可卡因一样有效(k_cat＝9.4s^-1和K_m＝1600nM)(Turner et al，2002；Larsen et al，2002)。