[发明专利]类固醇激素的定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及存在于皮肤角质层中的类固醇激素的定量方法。

背景技术

雌激素是属于类固醇激素中的一种性激素，又称卵泡激素或女性激素。雌激素由卵巢产生，运送至全身后与细胞质内的受体相结合，其结合体移动至细胞核内，以极微量在多方面表现出很强的生理作用。例如，对于皮肤，具有：(a)促进血液流动；(b)增加透明质酸等粘多糖类，提高皮肤的保湿能力；(c)通过增加弹性蛋白和胶原蛋白，从而赋予皮肤弹性等重要作用。

因此，尝试掌握生物体内的雌激素的浓度，已有以下方法，例如，从血清、唾液、尿、培养细胞、内脏器官得到的生物体来源的试料溶剂提取雌激素，使五卤化苄基化合物或五卤化苯甲酰化合物与该雌激素反应，然后进一步使1-低级烷基-2-卤化吡啶与其反应，采用LC-MS对所得到的反应混合物进行测定的方法(专利文献1)。

另一方面，角质层位于皮肤最外侧覆盖表皮，具有：抵御细菌和病毒入侵的屏障功能、防止皮肤的水分和保湿成分丧失的水分维持功能、以及缓解来自外界的刺激的保护功能等。然而，由于角质层是皮肤细胞在角化的过程中失去细胞核而形成的所谓死细胞，因而角质层中的雌激素浓度是不进行测定的，而皮肤中的雌激素浓度是通过采集皮肤组织或采血来测定的。

而且，涉及到属于类固醇激素的性激素的孕酮以及睾酮也同样，它们在生物体内的浓度测定通常由血清、唾液、尿等的采集构成，迄今为止尚没有从角质层测定的例子。

专利文献1：日本特开2006-138786号公报

发明内容

对此，本发明旨在能够简便地测定对于皮肤性状起重要作用的以雌激素为代表的类固醇激素在皮肤中的浓度。

本发明人发现，进入细胞核内表现出各种生理作用的雌激素等类固醇激素意外地存在于没有细胞核、即所谓的死细胞的角质层里，进而，通过胶带剥离法(tape stripping method)采集角质层，分析其中所包含的类固醇激素量，从而能够极为简便地测定角质层中的类固醇激素量。

即，本发明提供一种皮肤角质层中的类固醇激素的定量方法，其采用LC-MS，从通过胶带剥离法采集到的皮肤角质层定量分析类固醇激素。

根据本发明，通过对皮肤角质层的胶带剥离来采集皮肤角质层，对皮肤角质层中所包含的雌激素等类固醇激素浓度进行定量，因而能够减少受试者的负担。

并且，因为皮肤角质层位于皮肤的最外层，明显地反映皮肤内部的性状，所以知道皮肤角质层中的类固醇激素浓度，对于分析包括皮肤内部在内的全部皮肤的性状是有用的。

具体实施方式

本发明是采用LC-MS，从通过胶带剥离法采集到的皮肤角质层中定量分析雌激素等类固醇激素的方法。

在此，类固醇激素是指具有类固醇结构的激素，特别适合对作为女性激素的雌激素和孕酮、以及作为男性激素的睾酮进行定量。另外，雌激素是指雌二醇及雌二醇衍生物。

另外，所谓胶带剥离是将表面具有粘合剂层的胶带粘贴在受试部位，再将其剥离，使受试部位的表层粘附在胶带的粘合面上，进行回收的方法。

在本发明中，作为进行胶带剥离法的胶带，如果是贴紧皮肤后能够剥离的胶带即可，作为这样的胶带，可以使用市售的粘合性胶带。具体而言，其粘合剂层可以是橡胶类、丙烯酸类、硅酮类等粘合剂，而支撑粘合剂层的胶带本体可以是天然纤维，或者由合成纤维构成的纸或布，或者由聚酯、聚酰亚胺、聚苯硫醚、聚丙烯等构成的塑料片等。其中，从耐溶剂性及背景(background)(从胶带检出的类固醇激素的量)的观点出发，优选聚苯硫醚(PPS)。

另一方面，通过胶带剥离法采集到的皮肤角质层在身体上的部位没有特别限制，可以是在美容上皮肤性状较为重要的脸、头、胳膊等。

用于胶带剥离法的粘附有皮肤角质层的胶带可以裁断或者直接以其原样的状态，浸渍于乙醇、正己烷、丙酮、醋酸乙酯等溶剂中，提取类固醇激素，精制提取液。作为提取液的精制方法，优选进行柱分离，将杂质与类固醇激素分离并除去。

对于已精制的提取液中的类固醇激素，为了提高后续用LC-MS定量时候的检测灵敏度，优选适当地导入取代基，使其成为类固醇激素的衍生物。

例如，为了提高雌二醇的检测灵敏度，如日本特开2006-138786号公报(专利文献1)所记载，使五卤化苄基化合物或五卤化苯甲酰化合物与雌激素反应，在雌激素上导入五卤化苄基或五卤化苯甲酰基，同时使1-低级烷基-2-卤化吡啶与雌激素反应，在该雌激素上导入1-低级烷基吡啶鎓(pyridinium)。